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ハイライト

痛みを伴う変性関節疾患(DJD)のネコからの神経系組織を分析した。

DJD疼痛の神経生物学的サインを調べるために遺伝子発現を決定した。

健康な対照と比較して、DJDに罹患したネコにおいて、NGFの減少および脊髄におけるCX3CL1発現の増加があった。

健康な対照と比較して、DJDに罹患したネコにおいて、後根神経節においてATF3およびCX3CL1の発現が増加した。

そのような研究は、慢性のネコ科の痛みの抑制のための関連目標について情報を提供する可能性があります。
抽象
変性関節疾患(DJD)関連疼痛は、飼い猫およびヒトを含む他の種に影響を及ぼす臨床的に関連した一般的な症状である。疼痛の神経生物学的特徴の同定は、げっ歯類の疼痛モデルにおいて十分に開発されているが、そのような情報は、自然に発生する痛みを伴う状態を有する動物またはヒトから欠けている。本研究では、神経組織のためのハウスキーピング遺伝子(HKG)の同定およびげっ歯類モデルにおける慢性疼痛に関連すると考えられる遺伝子の発現レベルを、自然発生する変形性関節症の疼痛を有するネコで調べた。14匹の成猫を評価した – 7匹は変形性関節症性疼痛の臨床徴候なし、7匹は後肢X線撮影DJDおよび疼痛あり。含む、疼痛シグナル伝達遺伝子(の研究者が選択したセットの発現ASIC3、臨床的に健康な猫およびDJDを有する猫の腰髄後角および腰髄神経節組織におけるATF3、COX2、CX3CL1、NAV1.7、NAV1.8、NAV1.9、NGF、NK1R、TNFα、TRKA)を定量的に用いて研究した。 RT − PCR(qPCR)。
すべての組織サンプルにわたって最も安定していると同定されたHKGは、RPL30およびRPS19などの多くのリボソームタンパク質遺伝子であった。qPCRの結果は、臨床的に健康な対照と比較して、DJD罹患後根神経節においてATF3およびCX3CL1が上方制御されていることを示した。脊髄では、DJD罹患サンプルを健常サンプルと比較した場合、CX3CL1は上方制御され、NGFは下方制御された。自然発生疾患における疼痛の神経生物学、および飼い猫などのより不均一な集団におけるこれらの変化をどのげっ歯類モデルが予測しているかを理解するためには、さらなる研究が必要である。
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キーワード
ネコ変性関節疾患神経生物学的サイン変形性関節症疼痛
前書き
ネコ変性関節疾患(DJD)は、ネコ患者における運動機能障害と関連し得る(Gruenら、2014、Gruenら、2015、Lascelles、2010)。疼痛緩和が提供されると運動性が増加するように見えるので、この障害はDJDに関連する疼痛によると考えられている(Gruenら、2014年、Gruenら、2015年、Lascelles、2010年)。疼痛管理へのアプローチは2つの基本的なアプローチに分けることができます – 知られているか他の状態または他の種で有効であると考えられている鎮痛剤を試みる、または鎮痛剤の基礎標的種の標的病状に存在する神経生物学的変化の理論的評価に関する選択。この後者のアプローチは、疼痛の神経生物学的徴候に対して合理的な鎮痛薬の選択をすることとして説明することができます。現在、猫のDJDの痛みの神経生物学については何も知られていません。
疼痛の神経生物学を理解するための1つのアプローチは、正常状態と表現型的に明確に定義された病的状態との間の遺伝子発現の違いを調べることである。限られた仕事は犬のこれらのラインに沿って実行されています。Hegemann et al。(2005)の測定された遺伝子発現レベルのインターロイキン (IL)-1α、IL-1SS、IL-2 、IL-4 、IL-6 、IL-8 、IL-10、IL-12、IL-18、インターフェロンガンマ( IF-γ)、トランスフォーミング増殖因子β(TGFβ)、および腫瘍壊死因子α(TNFα)半定量的リアルタイムPCR法を用いて変形性関節症および免疫性多発性関節炎の犬から採取した滑液中 彼らは、罹患犬と罹患犬を比較したとき、これらの遺伝子のいくつかについて遺伝子発現レベルの差を報告したが、知見を疼痛の存在と関連づけなかった。痛みのレベルでもうまくいきます。他の研究者らは、イヌの変形性関節症軟骨における遺伝子発現の変化を評価している(Clementsら、2006年、Clementsら、2009年)。しかし、やはり、痛みの状態が存在するかどうかに対して結果は評価されなかった。
定量的リアルタイムPCR(qPCR)研究は、ネコアレルギー性皮膚疾患(Taglingerら、2008)、ネコ慢性歯肉口内炎(Harleyら、1999)およびネココロナウイルス感染症(Gelainら)における様々なサイトカインの発現レベルを評価した。、2006)。しかし、DJDの猫で疼痛に関連した遺伝子発現の変化を調べる研究は行われていません。
我々は、脊髄後根神経節(DRG)および後角(DH)における侵害受容性シグナル(疼痛)の発生および伝達経路における重要な点での遺伝子発現の変化を理解することに興味を持っていました。この研究では、我々は最初にDJDで最も安定した参照遺伝子を同定するために潜在的なハウスキーピング遺伝子のパネルを評価し、DRGと後角で健康な猫がこれまで行われていなかったので。最も安定した参照遺伝子が同定された後、以前に侵害受容に関連した遺伝子の選択げっ歯類モデルにおいて、そして著者らにとって興味あるものは、ネコのDJDに関連する疼痛の神経生物学的サインの特徴付けを開始することを可能にするために同じサンプルにおいてqPCRを用いて調べられた。ネコ科動物の疼痛関連組織における安定した参照遺伝子の同定は、ヒトの状態に対する潜在的な動物モデルとしてのネコの使用および獣医学における老化ネコの罹患率のために重要である。
材料および方法
動物たち
この試験は、NCSUの施設内動物管理使用委員会(IACUC、承認番号10-133-O、承認日:2010年10月27日)によって承認された。地元の動物保護施設で安楽死させた14匹の飼い猫、および安楽死前検査により既知の疼痛状態のものを試料採取に使用した。研究者らは安楽死の前にネコを評価して、それらが後肢関節に関連した痛みを持っていたかどうかを決定した。この研究とは無関係の理由で過量のバルビツール酸塩でネコを安楽死させた(個体群管理)、研究者はネコを安楽死させるための情報を得ていなかった。腰椎 軸骨格の安楽死直交デジタルX線写真の直後そして、後肢の虫垂関節を行い、そして以前に記載されたように(Discless、2010)、天然に存在するDJDを示すX線写真徴候の存在について評価した。足根は、抑圧と股関節を開き、視覚などDJDを示す巨視的病変の証拠について検査した前述の(フレイレら、2011)、前述(としてスコア Lascellesら2010 )。脊柱管の最後の胸椎から椎骨への仙骨が開かれたとの指標肉眼病変を評価した椎間板椎間板脱出および脊髄圧迫を伴う変性。要約すると、後肢関節の操作に不快感の兆候が見られた場合、猫は「痛みがある」と見なされました。それらの関節にはDJDの大きな証拠がありました。後肢に筋萎縮があり、それは体の他の場所には見られなかった。そして、椎間板脱出または脊髄圧迫の肉眼で見える徴候はありませんでした。
7匹の猫は、安楽死前評価において筋骨格痛がないと考えられ、自然発生の虫垂関節DJDと脊椎DJDがないと考えられ、正常なグループに含まれていた(デジタルX線写真および虫垂関節の巨視的検査で軸上異常は見られなかった)。スケルトン)。7匹のネコが後肢DJD群に含まれ、後肢の1つまたは複数の虫垂関節において中程度から重度のDJDを示すX線写真徴候を示した。脊椎圧迫性病変の証拠は存在しなかった。
組織採取
第3腰椎の中央体から第5腰椎の中央体までの腰椎(腰部膨張)を摘出し、両側から4、5および6番目の脊椎分節のDRGを切開して個別に保存した。採取した脊髄分節の左右のDHを解剖し、個別に保存した(少なくとも48 時間後にRNA に最初に曝した後)。解剖顕微鏡(Olympus SZX16、0.7×-11.5x)を用いて解剖を行った。脊髄の横断面を見て、白と灰白質 区別することができ、後角を簡単に識別することができます。脊髄の背側および腹側の側面は腹側中央裂溝の位置によって識別可能であり、頭側および尾側の側面は神経​​細根の配向を見ることによって決定される。硬膜腹部正中裂に続いて脊髄を開き、脊髄を左右の部分に分けた。中央運河のちょうど後方に配置された別の切断は、後方ホーンを腹側から分離することを可能にした。この切断は、脊髄の横断切断面上の後角に対応する灰白質の識別による分離を確実にするために慎重に行われた(補足図S1〜S4)。比較のために、脊髄の同じDRGおよびDHセグメントを正常なネコでサンプリングした。全ての組織サンプルを、後でサンプル処理まで−4 ℃で24 時間、 その後−20℃でRNA(Qiagen)中に保存した。
RNAの抽出と定量
Qiagen RNeasyキットおよびオンカラムDNase消化を用いてDRGおよびDHからの全RNAを抽出し、ゲノムDNAを除去した。製造業者のプロトコルに従ってクロロホルム抽出を行ったが、100%エタノール中でRNAを沈殿させる代わりに70%エタノールを添加し、その製造業者のプロトコルの最後までRNeasyキットの指示に従って混合物をRNeasy(Qiagen)カラムに適用した。抽出したRNAの量をNanodrop 分光光度計(Thermo Scientific、Wilmington、DE)で測定し、抽出したRNAを1.2%アガロース上で泳動することによって品質を評価した。28Sおよび18Sリボソームサブユニットの完全性を決定するためにゲル化する。(視覚的に決定して)約2の28S:18S rRNAバンド強度比を示す試料のみをこの研究に使用した。
定量的リアルタイムPCR
大容量cDNA 逆転写キット(Applied Biosystems Inc.、Foster City、CA)を使用して 、製造業者のプロトコルに従って500ngの全RNA を逆転写した。続いて、反応を1:20に希釈して、評価されるべき全ての遺伝子にとって十分な鋳型を提供した。以下のためのプライマー配列GUSB、HMBS、RPL17、RPS7、RPS19およびYWHAZはから得たペニングら。(2007)。残りのハウスキーピングおよび標的遺伝子プライマーは、SYBR Green Iと適合性があり、かつイントロンにまたがるようにBeacon Designer Software(カリフォルニア州パロアルトのBiosoft International)を用いて設計した。ゲノム汚染を検出するために。残りのハウスキーピング遺伝子および疼痛関連標的遺伝子のPCRプライマー配列を表1 に示す。
表1。参照遺伝子および標的遺伝子についてのプライマーおよびPCR増幅の詳細。
遺伝子 アニール温度(℃) 順方向配列(5′-3 ‘) 逆配列(5′-3 ‘) 商品サイズ(bp) NCBIアクセッション番号
ハウスキーピング遺伝子
ACTB 58 TCGCCGACAGGATGCAGAAG AGGTGGACAGCGAGGCCAGG 129 AB051104.1
B2M 58 TGGCGCGTTTTGTGGTCTTGGT TCTCTGCTGGGTGACGGGAGT 108 NM 001009876
RPL30 54 CTACGCCAGGACCGACGGGA TGACTGCACGGCGGGTTCTT 170 NM_001128841.1
RPS9 56 TGATCCGCCAGCGCCATATCAG GCATTCTTCCTCTTCACGCGACCA 148 ENSFCAT00000014052
疼痛関連標的遺伝子
ASIC 3 56 GTCACCAAGACTCTGTCT AGCCCAGAAGACACAGAT 82 ENSFCAT00000018953
ATF3 62 CCAAGTGCCGCAACAAGAAA CCATTCTGAGCCCGGACAAT 178 XM_847382.2
COX2 56 TAAGATTGTGATTGAAGACTATGT CAGTGGTAGAGTGTGTTAAAC 138 ENSFCAT00000005544
CX3CL1 62 CTTCCTCGGCCTCCTCTTCT GGCACCAGGACGTACGAGTT 148 ENSFCAT00000004693
NAV1.7 53 CAATCTTCCGTTTCAATG CAGTTCGTCAGAATAGTG 136 ENSFCAT00000000647
NAV1.8 58 GCTCGGGAACCTGGTGGTGC TGCCTTGGGCCAGGGTAGCA 205 ENSFCAG00000003166
NAV1.9 60 CTGCCGAGACCGAGGCCAAG CCCATGGCAACGAGAGCCTCC 85 ENSFCAT00000000236
NGF 56 GCAGGGCAGACCCGCAACAT GCACCACCCGCCTCCAAGTC 141 AJ639860.1
NK1R 62 CCAACAAGATTTATGAGAAAGTG GTAACGGTCAGAGGAGTC 146 ENSFCAT000000005986
TNFα 56 CAACTAATCAACCCTCTG CTACTACATGGGCTACTG 79 ENSFCAT00000004500
TRKA 62 AAGAGCGGGCTCCGTTTC TTAAAGGAGAGATTCAGGCGACT 77 ENSFCAT000000006915
bp、塩基対。
定量的PCRは 、 1μLの希釈cDNA、 400nmol / Lのフォワードおよびリバースプライマー、 10nmol / Lのフルオレセイン、ならびに1×Power SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems)からなる20μLの容量で行った。3段階増幅プロトコールをiCycler IQ(Bio − Rad)中で実施した。各反応には、95 ℃で7分間の 1サイクル、続いて95℃で30秒間の40サイクル、アニーリングのための 52℃〜62 ℃ での30秒間、および 72℃で30秒間の伸長が含まれた。各反応の特異性は、融解曲線分析(55℃で0.5の増加で開始する80サイクル)によって評価した。 サイクル毎に、滞留時間10秒で、各プライマー対からの1つのアンプリコンを同一性を確認するためにDNA配列決定した。反応は二連で行い、Ct値は二連について平均し、陰性対照は混入の可能性を検出するために含めた。重複測定がより0.5Cよりtが離れ、そのサンプルに対して繰り返さ又は分析から除去しました。
各検体からの等量のcDNAをプールに合わせることによって、各プライマー対について標準曲線を評価した。次いでプールを1:3、1:9、1:27、1:81および1:243に希釈した。組織およびプライマー対の種類に応じて、希釈を二連で評価して、90%から110%の範囲の増幅効率を計算した。
データ分析
BestKeeper(Pfafflら、2004)、geNorm(Vandesompeleら、2002)およびNormFinder(Ohlら、2006)を用いて、潜在的な参照遺伝子を評価し、これらの特定の組織において最も安定なものを選択した。
疼痛関連標的遺伝子の遺伝子発現の評価
健康なサンプルとDJDに罹患したサンプルとの間の倍率変化は、選択されたハウスキーピング遺伝子の幾何平均に対する正規化によって計算した。倍率変化の計算は、Pfaffl et al。(2002)。健康なサンプルおよびDJDサンプルの発現の変化は、Steibelらの研究に由来する線形混合モデルを用いて統計的有意性について評価された。(2009)。ベイズ情報量基準を使用して、モデルに含めるための最良のパラメーター(最も低いBICスコアに寄与するパラメーター)を選択しました。健康状態(健康対DJD)、リプロダクティブなどの固定要因DJDの状態(滅菌対無傷)、およびX線撮影スコア。無作為要因には、サンプルの位置(左対右)、猫の年齢、および性別に関する変数が含まれていました。モデルは、ネコの中に入れ子にされた所与のネコからの複製サンプルを用いて確立された。すべての分析はSPSSソフトウェア(バージョン24.0、IBM)を用いて行い、0.05のアルファ(α)をすべての分析に使用した。
結果
動物たち
DJD疼痛群に含まれる猫は2人の去勢男性、3人の無傷の男性および2人の去勢された女性であった。平均年齢(±標準偏差、SD)は12(1.4)歳、平均体重(±SD)は3.6(0.6) kg; ボディコンディションスコアの中央値は5/9でした。ネコの特性は表S1(補足データ)に詳述されており、そして全てが「疼痛陽性」と命名された。1つまたは複数の関節における両側後肢虫垂関節DJDが7匹のうち5匹のネコに存在し、脊髄の左右のDHおよび左右のDRGからの試料を分析した。DJD疼痛群の他の2匹のネコでは、1つのみの後肢のみがDJDに罹患した1つまたは複数の関節を有し、罹患側と同側の神経組織からの試料を採取した。健康なグループに含まれる研究された猫は2人の去勢された男性、3人の無傷の男性、1人は去勢された女性、そして1人は無傷の女性でした。平均年齢(±SD)は8.7(3.4)歳、平均体重(±SD)は4.2(0.9)だった kg; ボディコンディションスコアの中央値は5/9でした。サンプルをこれらのネコの右および/または左の神経組織から採取し、DJDを用いてネコに採取したサンプルと一致させた。
安定したハウスキーピング遺伝子解析
DJD罹患猫と非罹患猫から収集したDRGとDHの10の潜在的ハウスキーピング遺伝子を、3つの遺伝子発現参照遺伝子プログラムを用いて調べた。この研究で評価された10個の遺伝子は、Penningらによる以前の研究に基づいて選択された。(2007)それはネコの肝臓、腎臓、歯根、心臓と乳腺組織においてこれらの遺伝子の安定性を調べましたが、どんな中枢神経系組織においてもそうではありませんでした。調べた遺伝子はベータアクチン(ACTB )であった。ベータ−2−ミクログロブリン(B2M)。ベータグルクロニダーゼ(GUSB); ヒドロキシメチルシラン合成酵素(HMBS); チロシン3−モノオキシゲナーゼ/トリプトファン5−モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質 – ゼータポリペプチド(YWHAZ)。およびリボソームタンパク質 L17(RPL17)、L30(RPL30)、S7(RPS7)、S9(RPS9)とS19(RPS19)。
後根神経節(DRG)参照遺伝子
解剖エラーのため、2つのDRGがサンプルセットから欠落していました。しかし、14匹すべての猫を代表するDRGを、BestKeeperおよびNormFinderを使用して参照遺伝子パネルを評価するために使用した。これらのプログラムでは、欠測データが許容されるためである。そのプログラムは完全なデータを必要とするので、12匹の猫からの対になったサンプルだけがgeNormを使って評価されることができました。
調べたサンプルの大部分で増幅されたすべての遺伝子、ただしB2MはSD > 1であり、BestKeeperソフトウェアからの推奨に基づいて潜在的参照遺伝子として除去された。BestKeeperの結果に基づくと、ACTB、RPS19、およびRPS9はDRGサンプルで最も安定したハウスキーピング遺伝子でした。geNormから使用して結果RPS7、RPS9及びACTBは最も安定していました。そしてNormFinderは見つけ、geNorm及びBestKeeper両方異なっ結果生成RPL30、HMBS及びGUSBを DRGサンプルの中で最も安定な遺伝子として(表2)geNormの追加機能は、正確な正規化に必要な参照遺伝子の最適数を決定することです(図S2aとS2b)。0.15以下の発現安定性値に関連する参照遺伝子の数は、必要とされるハウスキーピング遺伝子の最適数と見なされる。ネコ試料で調べた組織のそれぞれについて、2対3の参照遺伝子を用いた正規化係数の変動は<0.15であり、これは必要とされる遺伝子の最適数が2であることを示している。しかしながら、3つのプログラムが2つの最も安定な遺伝子について常に一致するとは限らないので、3つが各組織型について選択された。これらの結果に基づいて、ACTB、RPS9、およびRPL30の幾何平均を各DRGサンプルの基準値として使用しました。
表2。BestKeeper、geNorm、およびNormFinderを使用した、各組織タイプの参照遺伝子ランキング。
プログラム 参照遺伝子の順位付け
後根神経節
ベストキーパー ACTB > RPS19 > RPS9 > RPL30 > HMBS > RPS7 > GUSB > YWHAZ > RPL17
geNorm RPS7 > RPS9 > ACTB > RPL30 > GUSB > RPS19 > HMBS > YWHAZ > RPL17 > B2M
NormFinder RPL30 > HMBS > GUSB > ACTB > RPS9 > YWHAZ > RPL17 > B2M > RPS7 > RPS19
後角
ベストキーパー HMBS > ACTB > YWHAZ > RPS9 > RPL17 > RPS19 > RPL30 > GUSB > B2M > RPS7
geNorm HMBS > RPL17 > ACTB > YWHAZ > RPS7 > RPL30 > RPS19 > GUSB > RPS9 > B2M
NormFinder HMBS > ACTB > RPL17 > RPS7 > RPS19 > YWHAZ > RPL30 > RPS9 > GUSB > B2M
後角参照遺伝子
この組織における潜在的なハウスキーピング遺伝子を評価するために、全部で24個のDHサンプル(DJDを有する猫からの12個および健康な猫からの12個)を使用した。10個全ての参照遺伝子が増幅され、SD <1であったので、全て参照遺伝子分析に含めた。DH中の最も安定な参照遺伝子の決定は3つの評価プログラムにわたって非常に一貫しており、HMBSが最も安定な遺伝子であった(表2)。ACTBは、BestKeeperとNormFinderを使用して次に安定しており、この遺伝子はgeNormを使用して3番目に安定していると位置づけられました。これらの結果に基づいて、幾何平均ACTB、HMBS、およびRPL17は DHサンプルの各々における基準値として使用しました。
疼痛関連標的遺伝子解析
一連の安定した参照遺伝子を各組織型について同定した後、げっ歯類の疼痛に関連する13の遺伝子を選択し(疼痛状態に関与する遺伝子の現在の知識に基づき(Foulkes and Wood、2008))、それらの発現レベルをDRGで比較した。 DJD罹患および健常サンプルこれらの遺伝子は、DJD猫において発現が増加すると仮定した:選択された遺伝子は以下の通りであった:酸感知イオンチャネル3(ASIC3 );活性化転写因子 3(ATF3);カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP));シクロオキシゲナーゼ2(COX2);ケモカイン(C − X 3 −Xモチーフ)リガンド1(CX3CL1 ); ナトリウムチャネル、電位依存型、アルファサブユニットタイプ IX(NAV1.7)、X(NAV1.8)およびXI(NAV1.9)。神経成長因子(NGF)。タキキニン受容体1(NK1R)。サブスタンスP(TAC1)腫瘍壊死因子アルファ(TNFα)。およびトロポミオシン受容体キナーゼA(TRKA)。各標的遺伝子について2つのプライマー対を設計したが、CGRPおよびTAC1について増幅は検出されなかった。それで、彼らはこの研究から除外されました。残りの11個の標的遺伝子についてDJD罹患ネコを健常対照ネコと比較した場合、ATF3およびCX3CL1はDRGにおいて有意に上方制御された(それぞれ1.639倍および1.069倍;表3)。
表3。臨床的に健康な対照猫と比較した変性関節疾患に罹患した猫から収集した後根神経節および後角サンプルの遺伝子発現結果。
遺伝子 FC FCの境界A P PCR効率(%)
後根神経節
ASIC 3 0.842 0.659〜1.075 0.269 99.8
ATF3 1.639 1.289-2.085 0.008 b 90.0
COX2 0.754 0.542〜1.050 0.237 100.9
CX3XL1 1.069 0.740〜1.545 0.024 b 110.0
NAV1.7 1.059 0.759-1.477 0.625 96.0
NAV1.8 0.953 0.700〜1.297 0.372 91.4
NAV1.9 1.081 0.784〜1.490 0.521 109.3
NGF 0.714 0.569〜0.896 0.374 99.5
NK1R 0.901 0.688〜1.180 0.306 100.0
TNFα 0.393 0.240〜0.646 0.143 100.0
TRKA 0.589 0.440-0.789 0.834 108.6
後角
COX2 0.396 0.312〜0.570 0.069 96.3
CX3CL1 1.878 0.359〜2.597 0.018 b 110.0
NGF 0.457 0.366〜0.570 0.043 b 95.8
NK1R 0.742 0.609-0.903 0.893 100.5
TNFα 1.177 0.892〜1.553 0.858 101.4
FC、フォールドチェンジ。
ある
FC範囲(±1標準誤差FC)
b
P < 0.05。
DHサンプル – ASIC3、COX2、CX3CL1、NAV1.7、NAV1.8、NAV1.9、NGF、NK1R、TNFα、およびTRKAでの検査のために10個の標的遺伝子を選択した。ASIC3、NAV1.7、およびTRKAは、PCR効率が90〜110%の許容範囲外であり、2つの遺伝子(NAV1.8およびNAV1.9)がいずれのDHサンプルでも増幅されなかったため除外されました。残りの5つの遺伝子のうち、CX3CL1はアップレギュレートされ(1.878倍)、NGFはDJDに罹患したサンプルでは、​​PH2は下方制御された(0.457倍)(表3)。
討論
で定量的PCR、複数の標的遺伝子が発現の変化を測定するために評価することができます。しかしながら、相対的な発現レベルを正確に決定するために、参照を使用して、異なる試料間のcDNA量の差について発現結果を正規化し、疾患状態にわたる標的遺伝子間の比較を可能にする。BestKeeper、geNorm、およびNormFinderは、特定の条件に対して最も安定な遺伝子として選択するために、潜在的な遺伝子を調べるための3つの異なるアプローチを提供します。
少なくとも3つの他の研究が、様々なネコ組織において適切な遺伝子発現ハウスキーピング遺伝子を同定した。Penning et al。(2007)彼らがテストしたリボソーム遺伝子の大部分が異なったネコの組織の適切な参照遺伝子であるように見えたことを発見しました。Wensman et al。(2007)異なる脳組織において6つの潜在的なハウスキーピング遺伝子をテストして、そしてHPRT、YWHAZとRPS7が最も安定していることを発見しました。ケスラー等。(2009)健康なネコの新生物、内分泌、血液、肝臓、腸そしてリンパ組織で10の潜在的な参照遺伝子をテストして、そのRPS7、ACTBとABL を見つけました最も安定的に発現されたハウスキーピング遺伝子であった。これらの他のネコ科の研究のどれも中枢神経組織を調べなかったが、我々の結果は類似しており、いくつかのリボソーム遺伝子とACTB は安定した参照遺伝子である。ラット後根神経節および後角サンプルにおいて、Piller et al。(2013)ACTBとHPRT、そしてまたRPL29とRPL13AがそれぞれDRGとDHサンプルの適切なハウスキーピング遺伝子であることを発見しました、そして、Wan等。(2010)RPL29、RPL3およびACTBを発見神経因性疼痛のラットモデルから分離されたDRGサンプルで最も安定しています。これらの他の研究に基づいて、多くのリボソーム遺伝子およびACTBがネコのDRGおよびDHサンプルにおいて最も安定であるという我々の発見は妥当である。
本研究で選択された標的遺伝子は、DJDの神経生物学を特徴付けることを目的とした、げっ歯類で行われた骨格痛に関する研究(Mantyh、2014)および疼痛状態に関与する遺伝子の知識(Foulkes and Wood、2008)の結果に基づいて選択された。 – 猫の痛み。それらはまた、利用可能であるかまたは開発中であるか、または神経障害性疼痛状態へのそれらの関与のために選択された。フラクタルカインとしても知られるCX3CL1のmRNAレベルは、DJDに罹患した猫のDRGにおいてより高く、これらの猫が神経因性疼痛状態を経験していたことを示唆している(Clark&Malcangio、2014)。DRGにおける遺伝子発現の変化を調べる研究では、活性化転写因子3(ATF3)は、末梢神経損傷後のDRGにおいて増加し(Shortlandら、2006)、最近ではげっ歯類のOAモデルにおいても増加することが示されている(Takurら、2012)。ATF3は神経細胞損傷と神経因性疼痛の指標と考えられています。同様の結果がの発現本研究で使用DJDの影響を受けた猫から分離されたのDRGに同定された ATF3が 1.6倍に増加し、さらには、DJDを持つ猫は状態のような神経因性疼痛を経験していることを示唆しています。
非常に少ない他の作業は、非げっ歯類種からDRGで行われますが、と馬にされてきた蹄葉炎比較し、後肢laminitic馬からDRGの免疫組織化学的分析、腰椎頚椎DRGとDRGの発現増加を示し ATF3を、と著者らは、これがかもしれ提案しました神経因性疼痛の指標となる(Jones et al。、2007)。多くの実験的疼痛モデルにおいて、COX2の発現は炎症および傷害に反応して脊髄において増加することが見出され(Vardeh et al。、2009)、疼痛の一因となっているが、我々はCOX2の有意差を観察しなかったDJDと健康的なサンプルを比較したとき。転写因子ATF3は、マウスの急性炎症中にCOX2レベルを負に調節することが示されており(Hellmann et al。、2015)、我々の結果は、同じ負の調節がDJD疼痛のネコにも起こっていることを示している。しかしながら、我々の結果は単一の横断的な慢性的な時点を反映していることを覚えておくことは重要です。疼痛のメカニズムは時間とともに変化する可能性があり、げっ歯類モデルの時間経過は非常に短くなる傾向があり、疼痛状態の後期のメカニズムを反映していない可能性があります。しかしながら、COX2に関する我々の発見を再び考慮して、研究者達はDJD関連の痛みを持つネコにおけるNSAIDの臨床的有益性を示すのに苦労しています(Gruen et al。、2015)。
DJDに感染した猫では、DRGサンプルで検出されたのと同様に、DHでCX3CL1の発現が有意に増加していることがわかりました。げっ歯類における研究は、CX3CL1およびその受容体CX3CR1が慢性疼痛へのミクログリアの寄与に関与する重要なシグナル伝達経路であることを示した。興味深いことに、フラクタルカインタンパク質は、カテプシンSを含むさまざまなプロテアーゼによって開裂されるまで膜結合型である。開裂した可溶型のフラクタルカインは、膜結合型ではなく神経因性疼痛に関連する( Clark&Malcangio、2014)。NGFも見つかりましたDHにおいて有意に差別的に発現されるが、他の疼痛モデルにおいて報告されたものの予想される方向ではない。興味深いことに、研究におけるモノクローナル抗体に神経成長因子(抗NGFモノクローナル抗体)(グルーエンら、2016 )、抗NGF mAbをおそらく減少し、活性および可動性で堅牢で長持ち改善をもたらし痛みで。これは、痛みの神経生物学、遺伝子発現、タンパク質への翻訳、および翻訳後修飾の包括的な理解のために、遺伝子の発現を単純に評価しても全体像がわからない場合があることを示す可能性があります。
まとめると、本発明者らの結果は、神経因性疼痛に関与すると考えられる遺伝子の発現の増加を示しており、DJD関連疼痛を有する猫における疼痛状態のような神経障害性の証拠であり得る。我々が選択したいくつかの遺伝子(これらは全て関節炎のげっ歯類モデルの疼痛において役割を果たすことが示されている)がDJD疼痛と健康な群との間で発現の変化を示すことが予想された。我々が選択した遺伝子間で変化が比較的少ないのにはいくつかの理由があります。げっ歯類モデルはまさにそれが誘導するモデルであり、そしてこれらのモデルは天然に存在する疼痛状態における疼痛の神経生物学を反映していないかもしれない。確かに、これは基本的な疼痛研究の効果的な新しい治療法への翻訳の欠如のために提案された理由の1つです(Lascelles et al。、2018)結果の解釈に織り込まれるべき私たちの研究のもう一つの側面は、私たちが集めた組織がさまざまな種類の細胞と実際には組織を含んでいたということです。私たちはDJDの痛みが確実にある、あるいは健康である猫だけを使うようにあらゆる試みをしました、しかし、私たちはそれぞれの猫についての詳細な歴史を持たず、そして私たちの痛みの状態は単に ‘yes’か ‘no’と指定されました。今後の研究では、より表現型の高い動物から(疼痛状態に関して)組織を採取するよう努めるべきである。疼痛の神経生物学はおそらく経時的にそして表現型の特徴(例えば過剰な感受性の有無にかかわらず)によって変化するので、これは特に重要である。我々の研究に変化がないことは、力の弱い研究と評価されたサンプルの不均一性を反映しているかもしれません。欠点にもかかわらず、我々の研究は、自然に発生する疼痛状態をより注意深く検討する必要性を指摘しており、そのような調査は新規の治療標的につながる可能性がある。しかしながら、我々の研究がそうであったように、出発点がげっ歯類モデルから知られているものに既に偏っている場合、小説、関連する目標を見逃す危険がある。
適切な安定したハウスキーピング遺伝子の選択は非常に重要であり、そしてこれまでネコの神経組織について行われたことはなかった。げっ歯類は、さまざまな人間の状態に適したモデルではないことを示し続けているため、猫などの他の自然発生疾患の動物モデルがますます普及し、正確な遺伝子評価研究には適切な参照遺伝子が必要になります。
結論
天然に痛みがあるネコの神経系組織の神経生物学的変化(遺伝子発現)を評価するという我々のアプローチは実現可能であると思われます。この小規模な研究の結果は、神経因性疼痛に関与していると考えられる遺伝子の発現が増加していることを示しており、DJD関連疼痛を有するネコにおける神経因性疼痛様疼痛状態の証拠となる可能性があります。我々の結果を確認し、そしてこれらの研究を拡大するためにさらなる研究が行われるべきである。
利益相反の声明
この研究のための資金は、慢性疼痛のある猫のための効果的な治療法の欠如を懸念している個人からの、PainプログラムのTranslational Researchへの私的寄付によって提供されました。JBは、モリス動物財団の補助金D08FE-043で雇用され、猫の慢性疼痛の評価ツールの開発に取り組んでいました。論文の内容に不適切に影響を与えたりバイアスをかけたりする可能性のあるその他の金銭的または個人的な関係はありません。
謝辞
この作品は、2013年6月にスペインのバルセロナで開催された欧州実験動物科学連盟連合会、および2014年6月に米国テネシー州ナッシュビルで開催されたACVIM研究フォーラムで発表されました。
付録A 。補足データ
以下は、この記事の補足資料です。
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