このエントリーをはてなブックマークに追加
Clip to Evernote

概要
目的
一過性受容体電位バニロイド1 (TRPV1)受容体の機能的変化を評価し、変形性関節症と同様の軟骨減少を伴う関節変性を有するラットモノヨードアセテート(MIA)誘発関節痛モデル(MIAラット)におけるその機序を明らかにする。
方法
MIAラットにおけるTRPV1の感作は、カプサイシン に応答して膝関節を神経支配している後根神経節(DRG)ニューロンのカプサイシン注射によって誘発される一過性の自発的疼痛行動によって評価した。TRPV1感作のメカニズムは、TRPV1 リン酸化を含むin vivoおよびin vitro でのプロテインキナーゼC(PKC)の機能解析および発現解析に続く、リン酸化TRPV1を検出する新しく開発されたサンドイッチ酵素免疫測定法によって解析されました。
結果
カプサイシンの関節内注射によって誘発された疼痛関連行動は、擬似ラットと比較してMIAラットにおいて有意に増加した。さらに、カプサイシン誘発内向き電流によって評価されるカプサイシン感受性は、MIAラットのDRGニューロンにおいて有意に増加した。TRPV1のタンパク質レベルは変化しないままであったが、Ser800でのリン酸化TRPV1はMIAラットのDRGニューロンにおいて増加した。MIAラットのDRGニューロンにおいて、リン酸化−PKC8(p − PKC8)は増加しそしてTRPV1と共局在した。MIAラットにおけるカプサイシン誘発疼痛関連行動は、PKC阻害剤ビスインドリルマレイミド Iの関節内前処置によって抑制された。さらに、PKC活性化物質ホルボール12-ミリステート13-アセテートの関節内注射はカプサイシン誘導疼痛関連行動を増加させた。正常ラット
結論
TRPV1は、PKC活性化を介してMIAラットの膝関節およびDRGニューロンにおいて感作された。したがって、TRPV1感作は、変形性関節症によって引き起こされる慢性疼痛に関与している可能性がある。
前の記事次の記事
キーワード
モノヨードアセテート後根神経節TRPV1プロテインキナーゼC関節痛
前書き
一過性受容体電位バニロイド1 (TRPV1)は、非選択性陽イオンチャネルの内因性リガンド(有害な熱、プロトン、脂質)および外因性リガンド(カプサイシン)によってゲート 1、 2 。それは無髄C-繊維で高度に発現され、そして複数の有害な刺激に反応して活性化される。遺伝的および薬理学的アプローチが実証TRPV1が炎症性疼痛の発症に関与している3、 4、 5、 6、 7、 8 。しかしながら、慢性疼痛条件下では、TRPV1の調節はとらえどころのないままである。変形性関節症(OA)はしばしば膝痛覚過敏を慢性疼痛(OA疼痛)に発症する。最近の研究は、OA疼痛におけるTRPV1の関与を報告しているが、膝の痛みを伴うOA下でのTRPV1の機能的変化は、ほとんど理解されていない。TRPV1発現はで増加した滑膜OA患者の9、及びIle585Val TRPV1変異体は、症候性膝OAのリスク低下と関連していた10。さらに、TRPV1の発現がで増加した後根 神経節ラットOA様疼痛モデルにおいて(DRG)11、12。したがって、TRPV1調節は、OA疼痛において起こり得る。モノヨードアセテート(MIA)を用いて、OA痛におけるTRPV1の機能的変化を調べた。関節痛モデル(MIAラット)。MIAはグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼを阻害し、MIAの関節内注射は軟骨細胞死を誘導し、その結果、OA疼痛の特徴に似ている関節変性を伴う関節変性および軟骨喪失を引き起こす。MIAラットは、一般の効果を調べるために使用される鎮痛剤とOAの痛みのメカニズム13、14、15、16。本研究はMIAラットの状況でinvivoおよびin vitroでのTRPV1の機能的変化を調べた。
材料および方法
実験動物
実験には、体重250〜350 gのオスのSprague Dawleyラット(Charles River Labs、横浜、日本)を使用した。全体として、243匹のラットを行動実験および電気生理学的実験に使用した。サンプルサイズは、以前の研究から決定された17、18 統計的差異を検出します。ラットは、温度と湿度が管理されたプラスチック製のケージに3匹ずつ収容され、12/12時間の逆の明暗周期で食物と水に自由にアクセスできた。(午前8時に点灯)。すべての手順は、シオノギ医薬品研究センター(大阪、日本)の内部動物管理および使用委員会によって承認された。すべての研究の結果は、動物に関する実験報告のため、ARRIVEガイドラインに従って報告された19、20。
MIAラットの誘導
MIAラットは、以前に記載されたようにして確立された21。簡単に説明すると、50μLの生理食塩水中の2mgのMIA(Sigma − Aldrich、米国ミズーリ州セントルイス)を、ハミルトン気密注射器を用いて右足膝関節の関節腔に注射した。偽手術ラットには食塩水を注射した。左脚膝関節は全てのラットにおいて未処置であった。処置中、全てのラットをイソフルランで麻酔した。MIAまたは生理食塩水注射後1、3、7、11、14、18、21、25および28日目に握力試験を用いて疼痛発生を測定した。グリップ強度は、以前に記載されているように、動物のグリップ強度システム(San Diego Instruments、San Diego、CA、USA)を使用して測定した17。簡単に説明すると、各ラットを穏やかに拘束し、それを用いて金網フレームを掴んだ。後肢を握り、グリップが外れるまで吻側から尾側に動かした。握力は、5分の最小間隔で2回の読みから平均した。MIAラットの選択基準は、<950握力(g)/体重(kg)値であった。全体として、147 / 172匹のラットが基準を満たした。
カプサイシン誘発疼痛関連行動の評価
ラット膝関節におけるTRPV1機能を調べるために、カプサイシン誘発疼痛関連行動をMIAまたは食塩水注射後14日目に評価した。ラットは体重と握力によって無作為に割り当てた。行動試験は明期に実施した。カプサイシン(Sigma-Aldrich)を生理食塩水中の10%エタノール50μLに溶解し、右脚膝関節の関節腔に注射した。盲検研究者によるカプサイシン注射後のプレキシグラスシリンダー(直径25cm、高さ30cm)中での10分間の尻込みおよび舐め行動の持続時間によって応答行動を測定した。ビスインドリルマレイミドI(PKC阻害剤、EMD Millipore、米国マサチューセッツ州ビレリカ)およびKT5720。(PKA阻害剤、EMD Millipore)を生理食塩水中の10%DMSO50μLに溶解し、カプサイシン注射の前に投与した。カプサイシン注射の前に、ホルボール12-ミリステート13-アセテート(PMA)(50μL、Invivogen、カリフォルニア州サンディエゴ)を投与した。薬物を膝関節腔内に投与して、膝関節におけるそれらの効果を調べた。ラットを割り当てられたグループの順番で試験した。
後根神経節(DRG)ニューロンの単離
ラットを深く下で断頭し、麻酔、右側L3及びL4 DRGを、低ナトリウムで単離し、培養したリンゲル液(212.5 mMスクロース、3mMの塩化カリウム、1mMののNaH 2 PO 4、25mMののNaHCO 3、11mMのD -グルコース、2mg / mLコラゲナーゼを含む5mM MgCl2(Yakult Pharmaceutical Industry Co.、Ltd.、東京、日本)を37℃で1時間、続いて室温で5分間0.05%トリプシン-EDTAで処理した。10%ウシ胎児血清(Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)を含むダルベッコ改変イーグル培地(Sigma-Aldrich )、20mM を含む培地中でDRGからニューロンを解離させるために粉砕を静かに適用した。HEPES(Gibco、Carlsbad、CA、米国)、1%ペニシリン – ストレプトマイシン溶液(Nacalai Tesque、京都、日本)、および4 mM l-グルタミン(Nacalai Tesque)。1500×での遠心分離後 gで5分間、DRGニューロンは、0.5μgの2.5 Sマウス含む培養培地中に再懸濁した神経成長因子ポリでプレコートしたガラスカバースリップ上に置き(ギブコ)、L個のリジンおよびラミニンを、37℃でインキュベート5%CO2で一晩。
電気生理学
MIAまたは食塩水注射後14日目に、ラットの膝関節へのWGA - Alexa 488の注射によってDRGニューロンを逆標識した。WGA - Alexa 488(Invitrogen、W11261)を2%w / vリン酸緩衝食塩水(PBS)に溶解し、断頭の72時間前に膝関節に注射した。外部記録溶液(145mMの塩化ナトリウム、2.5mMの塩化カリウム、2mMののBaCl 2は、1mMのMgCl 2、10mMのHEPES、および11ミリモルの次元-グルコース)をNaOHでpH7.4に調整しました。パッチ電極は、電極プラー(P97; Sutter Instrument Co.、Novato、CA、USA)を用いてホウケイ酸ガラスキャピラリーから製造した。パッチ電極のチップ抵抗は、内部溶液(135 mM CsCl、10 mM HEPES、10 mM)で満たしたとき1.8〜3.8MΩでした。EGTA、2のMgCl 2、3mMのATP-Mg及び0.3mMのGTP-トリス)のCsOHでpH7.2に調整しました。で全細胞構成、カプサイシン誘発性のBa2+電流をEPC-10アンプとPatchMasterソフトウェア(HEKA、フライブルク、ドイツ)で記録し、デジタル化された 10で のPowerLabとLabChartソフトウェア(ADInstruments、コロラド州とキロヘルツ、 米国)。
カプサイシン(0.03〜30μM)を、電流がプラトーに達するまでDRGニューロンに累積的に適用し、最大Ba2+電流を各濃度で測定した。各DRGニューロンにおけるカプサイシン誘導Ba 2+ 電流の EC 50値は、GraphPad Prism 4.0(GraphPad Software、San Diego、CA、USA)を用いて濃度応答曲線から計算した。カプサイシン誘導Ba2+電流の電流密度を評価するために、高濃度のカプサイシン(30μM)をDRGニューロンに適用し、最大Ba2+電流を測定した。電流は、各DRGニューロンの膜容量、およびカプサイシン誘導Ba 2+の電流密度によって正規化した。各DRGニューロンにおける電流はpA / pFとして表した。全ての記録は室温で行われた。
タンパク質溶解物調製
DRG タンパク質溶解物は、T-PER Tissue Protein Extraction Reagent(Thermo Scientific Pierce Protein Biology Products、イリノイ州、ロックフォード、PhosSTOPタブレット; Roche、インディアナ州、インディアナ州、アメリカ合衆国)中で組織をホモジナイズすることによって調製した。 )および4℃で5分間10,000× gで遠心分離し、上清を回収した。タンパク質濃度は、BCAタンパク質アッセイ – 還元剤適合キット(Thermo Fisher Scientific、横浜、日本)によって決定した。
ウエスタンブロッティング
DRG中のTRPV1、ホスホ-PKC8、またはPKC7のタンパク質レベルをウエスタンブロット分析により測定した。タンパク質溶解物を4〜12%SDS-PAGEで分離し、ブロッキングバッファー( Block Aceを含む0.1% Tween-20、DS Pharma Biomedical、Osaka、Japan)中で1時間インキュベートしたPVDFメンブレンに転写した。そして一次抗体(表I、ブロッキング緩衝液中)と共に4℃で一晩インキュベートした。次にそれらをペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG(TRPV1、111−035−003、1:10,000希釈用; Jackson Immuno Research Laboratories、ウェストグローブ、ペンシルベニア州、米国)、ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG(β用)と共にインキュベートした。 – アクチン、115−035−174、1:10,000希釈; C。室温で1時間、(Jackson Immuno Research Laboratories)またはペルオキシダーゼ標識抗ヤギIgG(PKC 8およびp − PKC 8の場合、705−035−003、1:10,000希釈; Jackson Immuno Research Laboratories)を用いて調製した。タンパク質は、ECL Prime Westernブロッティング検出試薬(GE Healthcare Life Sciences、東京、日本)を用いて検出した。各タンパク質バンドのシグナル強度は、Multi Gaugeソフトウェア(Fujifilm、東京、日本)を用いて評価した。
表I。ウエスタンブロッティングに使用された一次抗体のリスト
一次抗体 サプライヤー 種 タイプ 希釈 参照
抗TRPV1 サンタクルーズバイオテクノロジー(サンタクルーズ、カリフォルニア州、アメリカ) ウサギ ポリクローナル 1:300 sc-28759、ロット#G3010
抗リン酸化PKCɛSer729 サンタクルーズバイオテクノロジー やぎ ポリクローナル 1:200 sc-12355、ロット#C2113
アンチPKCɛ サンタクルーズバイオテクノロジー やぎ ポリクローナル 1:200 sc-214-G、ロット#J3002
抗βアクチン(クローンAC-15) Sigma – Aldrich(ミズーリ州セントルイス、アメリカ) マウス モノクローナル 1:2000 A1978、ロット#011M4812
ホスホ-TRPV1 ELISA
DRG中のリン酸化TRPV1の量を酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)によって測定した。抗原としてKLHコンジュゲートLQRRP(pS)LKSLFVDSCおよびVPLLRDA(pS)TRDRHATQQECをそれぞれ使用して、ウサギでSer502およびSer800のリン酸化TRPV1に対するポリクローナル抗体をSigma-Aldrichにより作成しました。簡潔には、各抗原について2匹のウサギを使用し、そして免疫化後の49日目および77日目(屠殺前1日目)に抗体力価を測定した。各ウサギからの血清を、ポジティブアフィニティー精製(リン酸化ペプチドを使用)、続いてネガティブアフィニティー精製(非リン酸化ペプチドを使用)によって精製した。抗体の特異性は滴定により確認されたリン酸化または非リン酸化ペプチドコートプレートを使用する。96ウェルMaxiSorpプレート(Nunc / Thermo Fisher、米国ニューヨーク州ロチェスター)を抗ホスホTRPV1抗体(各5μg / mL;ホスホSer502またはホスホSer800)で一晩4℃でコーティングし、次いでブロックした。室温で2時間、1%ブロックエースを用いて。0.05%Tween 20を含有するPBS(PBST)で3回洗浄した後、50μLのタンパク質溶解物を4℃で一晩インキュベートした。PBSTで洗浄した後、50μLのストレプトアビジン – ポリHRP(500ng / mL; Thermo Scientific、Waltham、MA、USA)とビオチン化抗TRPV1抗体(500ng / mL; Alomone Labs、Jerusalem、イスラエル)とを用いて調製した。 NHS-PEG 4 – ビオチン(Thermo Scientific)を各ウェルに室温で2時間置いた。PBSTで洗浄した後、50μLのTMB(Dako、Glostrup、Denmark)基質溶液を加えた。Envision 2102 Multilabel Reader(PerkinElmer、Waltham、MA、USA)を用いて硫酸および吸光度を450 nmで測定した。
免疫組織化学
右側L4 DRGを取り出し、最適切断温度化合物(Sakura Finetek、Torrance、CA、USA)中で凍結した。横断切片(10μm)をクライオスタット(CM1850; Leica、ドイツ、Nusloch)によって切断し、スライドガラス(Matsunam Glass、大阪、日本)上に解凍マウントした。切片をPBS中の4%パラホルムアルデヒドと共に10分間インキュベートした。PBS中で5分間すすいだ後、切片を3%(v / v)ウシ血清アルブミン(BSA)を含むブロッキング溶液と共に室温で1時間インキュベートし、一次抗体またはアイソタイプ対照(表II)と共に含む培地中でインキュベートした。4℃で一晩、3%(v / v)BSA。PBSで洗浄した後、切片をAlexaFluor488結合抗ヤギIgG抗体と反応させた。(1:500、Invitrogen、TRPV1用)およびAlexa Flour 594結合抗ウサギIgG抗体(1:500、Invitrogen、ホスホ-PKC7用)を室温で2時間。洗浄後、切片をVectashield(Vector Labs、Burlingame、CA、USA)でマウントし、カバーガラスをかけた。免疫組織化学的画像は、Keyence顕微鏡(Biorevo、BZ − 9000、大阪、日本)を使用して得た。
表II。免疫組織化学で使用される一次抗体とアイソタイプコントロールのリスト
サプライヤー 種 タイプ 希釈 参照
一次抗体
抗TRPV1 ニューロミクス(米国ミネソタ州エディナ) やぎ ポリクローナル 1:300 GT15129、ロット#401557
抗リン酸化PKCɛSer729 Abcam(ケンブリッジ、イギリス) ウサギ ポリクローナル 1時25分 ab63387、ロット#GR43554-4
アイソタイプコントロール
ヤギコントロールIgG ニューロミクス やぎ ポリクローナル 1:300 GT15900、ロット#400923
ウサギコントロールIgG アバカム ウサギ ポリクローナル 1:5 ab27478、ロット#GR166285-18
統計分析
全てのデータは平均値および対応する95%信頼区間(CI)として表される。P <0.05を統計学的に有意と見なした。ガウス分布はShapiroe-Wilk正規性検定によって分析しました。仮定からの逸脱が検出されたときは、ノンパラメトリック分析を使用した。擬似ラットとMIAラットとの間のDRGニューロンにおけるTRPV1、p-PKCγおよびTRPV1 リン酸化のレベルの変化、またはカプサイシンに対する感受性の変化の統計的有意性を、Mann-WhitneyのU 検定によって分析した。グリップ強度に対する経時的影響の分析は、反復測定分散分析を用いて行った。。ボンフェローニ検定は事後比較として行った。Steel-Dwass検定を使用して、MIAラットとシャムラット、PMA処置ラットとビヒクル処置ラット、またはプロテインキナーゼ阻害剤処置グループとビヒクルグループの間のカプサイシン誘発疼痛関連行動の差を決定した。分析は、SASソフトウェアバージョン9.4(SAS Institute、東京、日本)およびGraphPad Prism6ソフトウェア(GraphPad、米国)を用いて行った。
結果
MIAラットにおけるカプサイシン誘発疼痛関連行動の増加
本研究では、実験的なOA疼痛モデルとしてMIA誘発関節疼痛モデルを使用し、膝関節疼痛を確認するために握力を調べた。以前に報告されたように17、MIAの関節内注射は28日まで後肢の握力を低下させた[ 図1(A)、(F)(9、144)= 8.16、P <0.001]。偽造またはMIA注射後14日目に減少がプラトーに達したので、14日目のラットでさらなる調査を実施した。MIAを注射したラットの握力低下は、セレコキシブ(臨床的に使用されている疼痛治療用鎮痛薬)によって用量依存的に回復した(補足図1 )。著しい軟骨変性( MIA注射ラットにおいても 、P= 0.024)および滑膜炎(P= 0.012)が観察された(補足図2)。したがって、MIAラットは、OA疼痛の特徴(軟骨喪失を伴う関節変性)を発症した。 高解像度画像をダウンロード(198KB)フルサイズの画像をダウンロード 図1。MIAラットにおけるカプサイシン誘発疼痛関連行動の増加 (A)偽およびMIAラットにおける後肢握力の変化の経時変化(F(1,16)= 59.94、 注射群についてP<0.001; F(9144)= 39.79、 時間についてP<0.001; F(9144)。 )= 8.16、 相互作用についてP<0.001、偽:n = 8、MIA:n = 10)。(B)MIAまたは生理食塩水注射後14日目に、10μgのカプサイシンまたはビヒクル(生理食塩水中10%エタノール)を偽またはMIA治療同側膝関節に関節内注射し、そして応答時間を疼痛関連行動に費やした。 10分間測定した。データはSteel-Dwass検定(** P ビヒクル処置シャムラットVS = 0.002、†† P = 0.009、ビヒクル処置したMIAラット、VS ## P =カプサイシン処置したシャムラット、偽ビヒクル対0.002:N = 9、偽カプサイシン:N = 9、MIA – 車両:n = 11、MIA− カプサイシン:n = 9)。 MIAラットにおけるTRPV1の機能的変化を調べるために、カプサイシンを膝関節に投与し、疼痛関連行動を評価した。カプサイシン投与は、偽およびMIAラットにおいて疼痛関連行動を有意に誘導したが[図1(B); まぁ、P = 0.002、MIA。P = 0.009]、MIAラットでは偽ラットと比較して疼痛関連行動の持続期間が有意に増加した(P = 0.002)。対照的に、ビヒクル投与により誘発された疼痛関連行動は、MIAラットと偽ラットとの間で有意差はなかった(P = 0.92)。MIAラットにおけるカプサイシン誘発疼痛関連行動の増加は、TRPV1機能がMIAラットの膝において増強されたことを示唆した。 MIAラットのDRGニューロンにおけるカプサイシンに対する感受性の増加 膝関節の知覚神経は、関節内注射されたカプサイシンの標的であり、そしてTRPV1を介して疼痛シグナルを伝達すると考えられている。全細胞パッチクランプシステムを用いて膝関節を神経支配するDRGニューロンにおけるカプサイシンへの感度変化を調べた。カプサイシンは、偽ラットおよびMIAラットの両方の裏面標識DRGニューロンにおいて濃度依存的に内向き電流を増加させた。しかしながら、 カプサイシンによって誘導された内向き電流のEC50値は、擬似ラットとMIAラットとの間で有意に異なっていた[図2(A)、(B)。偽(3.6μM; 1.6、5.5)、MIA(1.3μM; 0.70、2.0)、P = 0.031]。MIAラットのDRGニューロンにおいてカプサイシンに対する感受性の増加が観察された。対照的に、TRPV1の機能的膜発現を示す高濃度のカプサイシン(30μM)によって誘導された内向き電流の電流密度は、擬似ラットとMIAラットとの間で変化しないままであった[図2(C)、(D)。偽(−43pA / pF; −77、−8.0)、MIA(−66pA / pF; −125、−6.6)、P = 0.65]。 高解像度画像をダウンロード(264KB)フルサイズの画像をダウンロード 図2。DRGニューロンにおけるカプサイシン誘導内向き電流 偽ラットおよびMIAラットの膝関節からのWGA − Alexa 488逆標識DRGニューロンを選択し、カプサイシン誘導内向き電流のEC50を決定した。電流がプラトーに達するまでカプサイシンをDRGニューロンに累積的に適用した。(A)EC 50DRGニューロンにおけるカプサイシン誘導内向き電流の減少は、偽ラットと比較してMIAラットにおいて有意に減少した。(B)偽およびMIAラットからのDRGニューロンからのカプサイシン誘導内向き電流の代表的な痕跡。(C)高濃度のカプサイシン(30μM)によって誘導された電流密度は、擬似ラットとMIAラットとの間で変化しなかった。(D)擬似およびMIAラットからの30μMカプサイシン誘導内向き電流の代表的な痕跡。(A、C)点は単一のDRGニューロン(n = 9)の結果を示し、そして水平バーは平均を示す。データは4つの独立した実験から得られ、各実験において3匹のラットからDRGニューロンがプールされた。データをマン – ホイットニーのU検定により分析した(*P = 0.031対擬似ラット)。 MIAラットのDRGにおけるTRPV1のタンパク質発現レベル 同側L3-4 DRGのTRPV1タンパク質レベルは、偽ラットとMIAラットの間で有意差はなかった[ 図3(A)、(B)。偽(100%; 52、148)、MIA(107%; 72、142)、P = 0.94]。したがって、MIAラットのDRGニューロンにおけるカプサイシンに対する感受性の増加は、TRPV1タンパク質発現の増加によるものではなかった。 高解像度画像をダウンロードする(124KB)フルサイズの画像をダウンロード 図3。DRG におけるTRPV1 タンパク質発現のウエスタンブロット分析。DRG タンパク質溶解物をラットの右側のL3およびL4 DRG から調製した。10マイクログラムのタンパク質溶解物をSDS-PAGEによって分離し、ウエスタンブロットによって分析した。(A)TRPV1(上)および β-アクチン(下)の代表的なウエスタンブロット分析。(B)TRPV1タンパク質発現の定量的結果。TRPV1タンパク質発現は、材料および方法に記載されているように定量し、そしてβ-アクチンレベルに対して正規化した。データは偽ラットに対する相対的発現を表す。DRGにおけるTRPV1タンパク質発現は、偽ラットとMIAラットとの間で変化しなかった。データはMann-Whitney U によって分析された- 検定(有意ではない、 偽ラットに対してP= 0.94、n = 5 /群)。 MIAラットのDRGニューロンにおけるTRPV1リン酸化 次に、TRPV1のリン酸化を測定することにより、TRPV1の機能変化を解析した。Ser502またはSer800でリン酸化TRPV1に対する新規抗体を開発し、ELISA システムを作成しました。TRPV1のホスホ-Ser502およびホスホ-Ser800は、TRPV1リン酸化を誘導するPMA刺激後、TRPV1 - CHO細胞では用量依存的に増加したが、対照CHO細胞では増加しなかった(補足図3)22。各抗原を用いた吸収試験は、TRPV1 − CHO細胞だけでなくDRGについてもELISA特異性を示した(補足図4)。)DRGにおけるリン酸化TRPV1レベルの分析は、Ser800でのリン酸化TRPV1が偽ラットと比較してMIAラットにおいて有意に増加したことを示した。しかしながら、Ser502におけるリン酸化TRPV1は、偽ラットとMIAラットとの間で変化しないままであった[図4(A)。偽(0.25; 0.23、0.27)、MIA(0.27; 0.24、0.30)、P = 0.31、[ 図4(B)]。偽(0.30; 0.26、0.33)、MIA(0.56; 0.53、0.60)、P = 0.002]。 高解像度画像をダウンロード(116KB)フルサイズの画像をダウンロード 図4。DRGにおけるリン酸化TRPV1のELISA。(A)Ser502でのホスホ−TRPV1は、擬似ラットとMIAラットとの間で変化しなかった。(B)MIAラットのDRGにおけるSer800でのホスホ-TRPV1の増加。DRGタンパク質溶解物を図3に記載の通りに調製した。5ナノグラムの各溶解物をELISAによって分析した。データはELISAにより得られた450nmでの吸光度を表す。データをマン – ホイットニーのU検定で分析した(** P = 0.002対擬似ラット、n = 6 /群)。 DRGニューロンにおけるPKCɛ発現およびTRPV1との共局在 DRG中のSer800でのリン酸化TRPV1の増加がMIAラットで観察されたので、PKC活性がMIAラットで増強されるかどうかを調べた。PKCɛはSer800にTRPV1をリン酸化するPKCのアイソフォームである22、23、24、25、26、およびSer729でリン酸化PKCɛはPKCɛ活性化のマーカーである27。抗ホスホPKC8(Ser729)抗体を用いたウエスタンブロット分析は、偽のラットと比較してMIAラットのDRGにおいてリン酸化PKC8が有意に増加したことを示した[図5(A)、(B)。偽(100%; 85、115)、MIA(146%; 115、177)、P= 0.008]。免疫組織学的分析は、小から中直径のDRGニューロンにおいて、TRPV1と共局在するリン酸化PKCγの発現を示した[ 図5(C)]。 高解像度画像をダウンロードする(504KB)フルサイズの画像をダウンロード 図5。MIAラットのDRGにおけるリン酸化PKC8の増加。図3のように調製した10マイクログラムのタンパク質溶解物をウエスタンブロットにより分析した。(A)ホスホ−PKC8(p − PKC8;上)および全PKC8(下)の代表的なウエスタンブロット。(B)総PKC8によって正規化された、DRG中のリン酸化PKC8レベルの定量的結果。データは偽ラットに対する相対的発現を表す。データをマン – ホイットニーのU検定で分析した(** P = 0.008対擬似ラット、n = 5 /群)。(C)ホスホ−PKC8およびTRPV1の免疫組織化学的分析MIAラットのDRGニューロンにおける。MIAラットのDRGにおけるTRPV1(緑色、DRGニューロンの29±4.4%)およびホスホ−PKC8(赤色、DRGニューロンの82±6.7%)の併合画像(黄色、19±3.2%のDRGニューロン)。示された。図は3つの独立した実験からの代表的な画像を示す。スケールバーは100μmを表す。 MIAラットにおけるカプサイシン感受性に対するプロテインキナーゼ阻害剤の関節内注射の効果 MIAラットにおけるTRPV1感作のメカニズムは、PKCシグナル伝達、特にPKC8によるSer800でのTRPV1リン酸化を含み得る。したがって、我々は次に、MIAラットにおけるカプサイシン感受性の増加の発生に対するPKC阻害剤の効果を調べた。PKA阻害剤(KT5720)ではなく、PKC阻害剤(ビスインドリルマレイミドI; BIS)の関節内注射は、MIAラットにおいてカプサイシン感受性の増加を抑制した[図6(A)、(B)]。対照的に、どちらの阻害剤も偽ラットにおけるカプサイシン誘発疼痛関連行動に影響を及ぼさなかった。したがって、MIAラットにおけるカプサイシン感受性の増加は、TRPV1のPKC誘導リン酸化によって媒介された。しかしながら、PKCおよびPKA阻害剤は両方ともMIAラットにおける握力の低下を逆転させた(補足図5)。PKA阻害剤の投与量がPKA活性を遮断するのに十分であることを示唆する。 高解像度画像をダウンロードする(157KB)フルサイズの画像をダウンロード 図6。MIAラットにおけるカプサイシン誘発疼痛関連行動に対するプロテインキナーゼC(PKC)およびプロテインキナーゼA (PKA)阻害剤の効果 データはSteel-Dwass検定によって分析された。(A)PKC阻害剤、ビスインドリルマレイミドI(BIS)の事前投与は、MIAラットにおいてカプサイシン誘発疼痛関連行動を阻害した(*P = 0.012対ビヒクル処置偽ラット、n = 9 /群)。(B)PKA阻害剤、KT5720の予備投与は、MIAラットにおいてカプサイシン誘発疼痛関連行動を阻害しなかった(† P = 0.014対ビヒクル処置偽ラット、#P KT5720で処置した偽ラットに対して、= 0.011、偽 – ビヒク​​ル:n = 6、偽 – KT5720:n = 6、MIA− ビヒクル:n = 7、MIA − KT5720:n = 8)。(A、B)10マイクログラムのカプサイシンを、偽またはMIA処理した同側膝関節に関節内注射し、そして疼痛関連行動の持続時間を10分間記録した。カプサイシン注射の1時間前に、BIS(5nmol)およびKT5720(10nmol)を関節内投与した。 カプサイシン誘発疼痛関連行動に対するPKC活性化剤の効果 MIAラットにおけるカプサイシン感受性の増加に対するPKCの関与を調べるために、本発明者らは、PKCアクチベーター(PMA)の投与が正常ラットにおいてカプサイシンに対する応答を増加させるかどうかを調べた[図7]。カプサイシン注射によって誘発された疼痛関連行動は、PMAの事前投与後に有意に増加した(P = 0.006)。しかしながら、PMA投与単独では正常ラットにおいて疼痛関連行動を誘発せず(P = 0.51)、これはPKC活性化が膝関節におけるカプサイシン感受性の増大を誘発するのに十分であることを示唆している。 高解像度画像をダウンロードする(85KB)フルサイズの画像をダウンロード 図7。正常ラットにおけるカプサイシン誘発疼痛関連行動に対するホルボール12‐ミリステート13‐アセテート(PMA)の効果 カプサイシン注射の15分前に、10ピコモルのPMAまたはビヒクル(食塩水中の10%エタノール)を関節内投与した。10マイクログラムのカプサイシンを関節内注射し、疼痛関連行動の持続時間を10分間記録した。Steel-Dwass検定によりデータを分析した(** P = 0.006対ビヒクル注射群で処置したビヒクル、## P = 0.003対ビヒクル注射群で処置したビヒクル、†† P = 0.006 vsビヒクル注射群で処置したビヒクル、ビヒクル。 – 車:n = 7、車 – カプサイシン:n = 8、PMA−ビヒクル:n = 8、PMA−カプサイシン:n = 9)。 討論 本研究はMIAラットにおけるTRPV1の感作をin vivoおよびin vitro でカプサイシン誘導反応を調べることによって調べた。以前に報告されているように13、14、15、16 、MIAラット開発OA-等による疼痛、関節変性と軟骨損失、およびに応答セレコキシブ OAの痛みのために臨床的に使用されます。それらは再現性が高く、85%のMIA注射ラットが関節痛を発症した。 in vivo でのカプサイシンに対する感度の向上カプサイシン誘発内向き電流に対するカプサイシンの関節内注射後およびDRGニューロン内では、TRPV1がMIAラットにおいて感作されていることが示される。 疼痛条件下で増加TRPV1機能は、TRPV1のtotal-又は膜配置表情の変化、又はによるTRPV1の機能的変化に起因することができるリン 18、28、29。以前の研究では、MIAラットにおけるDRG TRPV1発現の変化を示し11、30 。ある研究では減少を示したTRPV1タンパク質によってDRGにおける発現をELISA MIA注射の同側に30、および別のMIAラットの膝関節からバック標識DRGにおけるTRPV1免疫陽性ニューロンの数の増加を示した11。ここでは、我々はTRPV1タンパク質発現だけでなく、膝関節からの背面標識DRGニューロンにおけるTRPV1機能性膜発現もMIAラットにおいて変化しないことを示した。これらの結果は、TRPV1発現の変化がMIAラットにおけるTRPV1機能の増強に関与していなかったことを明らかに示している。しかし、DRGニューロンの発現変化なしに膝関節の求心性終末へのTRPV1転座の増加が起こる可能性があります。TRPV1発現の変化は観察されなかったので、我々はTRPV1の機能的変化を調べた。TRPV1とのバランスリン酸化および脱リン酸化は、 TRPV1機能調節26、31、32 。さらに、TNF-αなどの炎症性サイトカインそしてOAで増加されるNGFは、リン酸化し、TRPV1の機能増強29、33、34。リン酸化TRPV1を定量するために、リン酸化TRPV1に対する新規抗体を開発し、ELISAを作製した。Ser 800でのリン酸化TRPV1は、MIAラットのDRGにおいて有意に増加した。これは、インビボおよび動物性疼痛モデルにおいて直接、特定の残基部位におけるTRPV1リン酸化の変化を検出する最初の研究である。しかしながら、Ser502でのリン酸化TRPV1は、偽ラットとMIAラットとの間で変化しなかった。Ser800は対照的に、リン酸化Ser502はカプサイシン刺激による脱リン酸化された31、35。Ser502およびSer800でのTRPV1のリン酸化および脱リン酸化は、病的状態において独立して調節されている可能性がある。神経因性疼痛などの他の疼痛モデルにおけるTRPV1のリン酸化、およびMIAラットとの比較に関するさらなる研究は、各TRPV1リン酸化残基の調節機構を同定し得る。TRPV1 − CHO細胞およびDRGの両方における各抗原の吸収試験により本発明者らの新規ELISAシステムの特異性を確認したが、作製された抗体はウエスタンブロッティングまたは免疫組織学には適していなかった(データは示さず)。不動化によって損なわれる。 次に、我々はSer800でのTRPV1リン酸化のメカニズムについて述べた。PKCɛはSer800にTRPV1をリン酸化35と感受性侵害受容器 36、37 。PKC8はリン酸化によって活性化され、そしてリン酸化PKC8免疫陽性ニューロンの頻度はカラギーナンまたは完全フロイントアジュバント誘導炎症性疼痛モデル27のDRGにおいて増加した。ここで、本発明者らは、リン酸化PKCγがMIAラットのDRGにおいて定量的に増加し、TRPV1と共局在していることを示し、Ser800でのTRPV1リン酸化がMIAラットにおけるPKCγ活性化によって誘導されることを示す。興味深いことに、慢性狭窄損傷の DRGではリン酸化PKCγ免疫陽性ニューロンの頻度が減少した神経因性疼痛モデル27。したがって、MIAラットは、分子レベルで神経因性疼痛モデルと比較して炎症性疼痛モデルに類似している。MIAラットの膝関節における増強されたTRPV1機能の発達におけるPKCβの関与を確認するために、我々はPKC阻害剤を使用した。 PKC阻害剤による関節内前処置は、MIAラットにおいてカプサイシン感受性の増加を抑制し、PKCがMIAラットの膝関節におけるTRPV1機能を増強することを示唆している。PKC阻害剤ビスインドリルマレイミド Iは、他の阻害キナーゼ例えばPKAおよびAS グリコーゲンシンターゼキナーゼ-3の高濃度では 38、 39。ここで、ビスインドリルマレイミドIは偽ラットにおけるカプサイシン誘発疼痛関連行動に影響を及ぼさず、そしてPKA阻害剤はMIAラットにおけるカプサイシン誘発疼痛関連行動を減弱させず、ビスインドリルマレイミドIがPKC特異的であることを示唆する。さらに、PKC活性化剤であるPMAの関節内注射は、正常ラットにおいてカプサイシン誘発疼痛関連行動の増加を誘発した。PMAはTRPV1を感作する22、および疼痛を調節する他の受容体40。しかしながら、PMA投与自体は正常ラットにおいて疼痛関連行動を誘導しなかったので、カプサイシンによって誘導された疼痛関連行動の増加はTRPV1感作を意味する。これらの結果は、膝関節における増強されたTRPV1機能の発達におけるPKCの関与を支持する。さらに、PKA阻害剤、KT5720による治療は、偽またはMIAラットにおけるカプサイシン誘発性疼痛関連行動に影響を及ぼさなかった。PKAは、TRPV1へのトランスロケーションを増加させることによって、カプサイシン誘発性の応答を増大させる細胞表面膜41、 42。機能的DRG TRPV1膜発現における有意な変化は電気生理学的分析によって観察されず、PKAはMIAラットにおけるTRPV1機能の増強に関与していないことを示した。しかしながら、ビスインドリルマレイミドIおよびKT5720処置はMIAラットにおいて鎮痛性でありそして握力の減少を逆転させ、PKAがTRPV1とは無関係にMIAラットにおいて関節痛を媒介する侵害受容器を活性化することを示唆する。TRPV1のPKAを介したリン酸化は、三叉神経節ニューロンの炎症性痛覚過敏を伴う 43。痛覚過敏の発症に対するPKCおよびPKAの関与は、疾患の種類またはニューロンの間で異なり得る。以前の研究では、病的な痛みTRPV1機能の変化を示した9、18、28、44。脊髄にカプサイシン誘発性のCGRPの放出が増加し44、関節の感作求心性ニューロン OAモデルラットで9 、および中PKCの関与糖尿病性神経障害のモデルラットと中骨癌疼痛モデルラット18、28が報告されました。したがって、TRPV1リン酸化は、OA疼痛における過敏症の発症に関与している可能性がある。しかしながら、これらの研究は、特にOA疼痛において、リン酸化TRPV1残基を同定したり、インビボでのPKC阻害の効果を調べたりしなかった。ここで、我々はSer800でのTRPV1リン酸化の直接的証拠を見出した。生体内で、同様MIAラットにおける強化TRPV1機能への接続。Ser800は重要なTRPV1感作部位であり、これはカプサイシン、熱、または酸に対する反応を増加させる45。したがって、TRPV1機能の変化は膝の痛みを伴うOAに関与している可能性があります。しかしながら、それらは、OA疼痛を引き起こしそして維持するためのTRPV1変化の重要性を説明するには不十分である。最近、TRPV1拮抗薬は強力有することが示された鎮痛効果 OA疼痛モデルにおける 9、44。TNF -αのような炎症性サイトカインはTRPV1リン酸化を誘導した。そしてリン酸化されたTRPV1は正常な体温によって開閉されました46。さらに、TRPV1のSNPは、カプサイシンに対する感受性の低下およびヒトにおける熱刺激をもたらし、症候性膝関節炎のリスク低下と関連していた10。したがって、TRPV1は、OA疼痛において重要な役割を果たす可能性がある。増強されたTRPV1機能のインビボ機能、およびその臨床的OAとの相関に焦点を当てたさらなる研究は、この研究からの結果の有意性を理解するために必要とされる。 結論として、TRPV1機能は、DRC ニューロンおよびMIAラットの膝関節において、PKCγによるTRPV1リン酸化を介して増強された。これらの知見は、膝のOA疼痛メカニズムの理解、およびOA疼痛に対する強力な新規鎮痛薬としてのTRPV1拮抗薬の使用を強化するものです。 投稿者の投稿 KKとKHはこの仕事に等しく貢献しました。KKはデータを集めて分析し、研究をデザインし、そして論文を書いた。KHはデータを収集し分析し、研究デザインに参加し、そして論文を作成するのを助けました。KOとKTはすべての電気生理学的研究を行った。SIはELISA研究を作成し実施した。YSはMIAラットの膝関節損傷の組織学的研究を行った。HO、MF、MYは技術サポートを行い、研究デザインに参加しました。IFは抗体を設計し、検証した。SYはELISA研究に助言を与えた。AMは抗体検証について助言を与えた。TAとTKはその概念を開発し、助言を与えました。GSは概念的なアドバイスをしました。YMはプロジェクトを監督し、論文を編集しました。すべての作家は結果および含意を論議し、すべての段階で原稿にコメントした。 資金源の役割 すべての資金は塩野義製薬株式会社によって提供された。 競合する利益 執筆者は全員、データ収集時および原稿執筆時のシオノギ株式会社の全従業員でした。 付録A 。補足データ 以下は、この記事に関連する補足データです。 Word文書のダウンロード(851KB)docxファイルに関するヘルプ 参考文献 1 SE Jordt 、M. 富永、D. ジュリアス キー外サイトによって決定カプサイシン受容体の酸性増強 Proc Natl Acad Sci US A 、97 (14 )(2000 )、pp。8134 – 8139 Scopus Google ScholarのCrossRef ビューレコード 2 D. スマート、MJ Gunthorpeさん、JC Jerman 、S. ナシル、J. グレイ、AI ミュア、ら。 内因性脂質アナンダミドはヒトバニロイド受容体(hVR1)に対する完全アゴニストである Br J Pharmacol 、129 (2 )(2000 )、PP。227 – 230 Scopus Google ScholarのCrossRef ビューレコード 3 MJ カテリーナ、A. レフラー、AB Malmberg 、WJ マーティン、J. トラフトン、KR ピーターセン、ザイツ、ら。 カプサイシン受容体を欠くマウスにおける侵害受容障害および疼痛感覚 科学、288 (5464 )(2000 )、頁306 – 313 Scopus Google ScholarのCrossRef ビューレコード 4 JB デイビス、J. グレイ、MJ Gunthorpeさん、JP ハッチャー、PT デイビー、P. Overend 、ら。 バニロイド受容体1は炎症性熱痛覚過敏に必須である ネイチャー、405 (6783 )(2000 )、頁183 – 187 Scopus Google ScholarのCrossRef ビューレコード 5 NR Gavva 、R. タミール、Y. ク、L. Klionsky 、TJ 張、D. Immke 、ら。 AMG 9810 [(E)‐3‐(4 ‐ t‐ブチルフェニル)‐N‐(2,3‐ジヒドロベンゾ[b] [1,4]ジオキシン‐6‐イル​​)アクリルアミド]、新規バニロイド受容体1(TRPV1)抗痛覚過敏特性を有する拮抗薬 J Pharmacol Exp Ther 、313 (1 )(2005 )、pp。474 – 484 Scopus Google Scholarでレコードを表示する 6 P. サントノーレ、CT Wismer 、J. Mikusa 、CZ 朱、C. 忠、DM Gauvin 、ら。 新規過渡受容体電位V1型受容体拮抗薬、A ‐ 425619 [1‐イソキノリン‐5‐イル‐3‐(4‐トリフルオロメチル – ベンジル) – 尿素]はラットの炎症と組織損傷に関連する病態生理学的疼痛を軽減する J Pharmacol Exp Ther 、314 (1 )(2005 )、pp。410 – 421 Scopus Google ScholarのCrossRef ビューレコード 7 SG Lehto 、R. タミール、H. トウ、L. Klionsky 、R. クァン、A. ル、ら。 (R、E)‐N‐(2‐ヒドロキシ‐2,3‐ジヒドロ‐1H‐インデン‐4‐イル)‐3‐(2‐(ピペリジン‐1‐イル)‐4‐(トリフルオロメチル)フェニル)の抗痛覚過敏効果において温熱を引き起こさない新規一過性受容体電位バニロイド1型モジュレーター、)) – アクリルアミド(AMG8562) J Pharmacol Exp Ther 、326 (1 )(2008 )、pp。218 – 229 Scopus Google ScholarのCrossRef ビューレコード 8 L. Tafesse 、T. 金政、N. 黒瀬、J. ゆう、T. あさき、G. ウー、ら。 構造 – 活性相関研究および強力な一過性受容体電位バニロイド(TRPV 1)きっ抗薬4‐ [3‐クロロ‐5 – [(1S)‐1,2‐ジヒドロキシエチル] ‐2‐ピリジル] ‐N‐ [5‐(5)の発見疼痛管理のための臨床的候補としてのトリフルオロメチル)-2-ピリジル] -3,6-ジヒドロ-2H-ピリジン-1-カルボキサミド(V116517) J Med Chem 、57 (15 )(2014 )、pp。6781 – 6794 Scopus Google ScholarのCrossRef ビューレコード 9 S. ケリー、RJ チャップマン、S. Woodhams 、DR サーガル、J. ターナー、JJ Burston 、ら。 変形性関節症疼痛のラットモデルにおける関節レベルでの共侵害受容性TRPV1の機能増加 Ann Rheum Dis (2013年10月23日)、10.1136 / annrheumdis-2013-203413 Google Scholar 10年 AM Valdes 、G. De Wilde 、SA Doherty 、RJ Lories 、FL Vaughn 、LL Laslett 、他。 Ile585Val TRPV1変異体は痛みを伴う膝変形性関節症のリスクに関与している Ann Rheum Dis 、70 (9 )(2011 )、pp。1556 – 1561 Scopus Google ScholarのCrossRef ビューレコード 11 J. Fernihough 、C. ジェントリー、S. ベヴァン、J. 冬 変形性関節症のラットモデルにおけるカルシトニン遺伝子関連ペプチドの調節およびTRPV1 Neurosci LETT 、388 (2 )(2005 )、頁。75 – 80 記事のダウンロードPDFを見るScopus Google Scholar 12年 S. Adães 、M. Mendonça 、TN サントス、JM カストロ・ロペス、J. フェレイラ・ゴメス、FL ネト 変形性関節症に関連した痛覚を研究するための別のモデルとしてラットの膝におけるコラゲナーゼの関節内注射 Arthritis Res Ther 、16 (1 )(2014 ) Google Scholar 13年 AM Malfait 、CB Little 、JJ McDougall 小動物における変形性関節症の痛みのモデリングに関する解説 変形性関節症軟骨、21 (9 )(2013 )、pp。1316 – 1326 記事のダウンロードPDFを見るScopus Google Scholar 14年 C. ゲンギャン、P. Gegout-Pottie 、L. フィリップ、B. Terlain 、P. ネッター、P. ジレ モノヨードアセテート誘発性実験的変形性関節症:可動性の喪失の用量応答研究、形態学、および生化学 Arthritis Rheum 、40 (9 )(1997 )、pp。1670 – 1679 Scopus Google ScholarのCrossRef ビューレコード 15年 RE グスマン、MG エバンス、S. ボーブ、B. Morenko 、K. キルゴア ラット大腿脛骨関節の軟骨下骨および関節軟骨におけるモノヨードアセテート誘発性の組織学的変化:変形性関節症の動物モデル Toxicol Pathol 、31 (6 )(2003 )、p.619 – 624 Scopus Google ScholarのCrossRef ビューレコード 16 AK Suokas 、DR Sagar 、PI Mapp 、V. Chapman 、DA Walsh Design、OA疼痛のモデルにおける薬物の研究の質と鎮痛効果の証拠:系統的レビューとメタアナリシス 変形性関節症軟骨、22 (9 )(2014 )、pp。1207 – 1223 記事のダウンロードPDFを見るScopus Google Scholar 17年 P. Chandran 、M. Pai 、EA Blomme 、GC Hsieh 、MW Decker 、P. Honore 変形性関節症のラットモデルにおける運動誘発性疼痛の薬理学的調節 EUR J Pharmacol 、613 (1-3 )(2009 )、頁。39 – 45 記事のダウンロードPDFを見るScopus Google Scholar 18年 S. ホン、JW ワイリー 初期の痛みを伴う糖尿病性神経障害は、示差発現の変化とバニロイド受容体1の機能に関連付けられています J Biol Chem 、280 (1 )(2005 )、pp。618 – 627 Scopus Google ScholarのCrossRef ビューレコード 19年 C. キルケニー、WJ ブラウン、IC Cuthill 、M. エマーソン、DG アルトマン 改善バイオサイエンス研究報告:動物の研究を報告するためのガイドラインに到着 PLoS Biol、8(6)(2010)、p。e1000412 Scopus Google ScholarのCrossRef ビューレコード 20 C. キルケニー、WJ ブラウン、IC Cuthill 、M. エマーソン、DG アルトマン 改善バイオサイエンス研究報告:動物の研究を報告するためのガイドラインに到着 変形性関節症軟骨、20 (4 )(2012 )、pp。256 – 260 記事のダウンロードPDFを見るScopus Google Scholar 21 JD Pomonis 、JM Bouletさん、SL Gottshall 、S. フィリップス、R.の 売り手、T. バントン、ら。 変形性関節症痛のラットモデルの開発と薬理学的特性 Pain 、114 (3 )(2005 )、pp。339 – 346 記事のダウンロードPDF CrossRef Scopusでの記録を見るGoogle Scholar 22 M. Numazaki 、T. 富永、H. 豊岡、M. 富永 プロテインキナーゼCイプシロン及び2つの標的セリン残基の同定によりカプサイシン受容体VR1の直接リン酸化 J Biol Chem 、277 (16 )(2002 )、pp。13375 – 13378 Scopus Google ScholarのCrossRef ビューレコード 23 G. Bhave 、HJ のHu 、KS Glauner 、W. 朱、H. 王、DJ Brasier 、ら。 プロテインキナーゼCリン酸化はカプサイシン受容体一過性受容体電位バニロイド1(TRPV1)を感作するが活性化しない PROCナショナル・アカデミーサイエンス米国A 、100 (2003 )、頁1.248万- 12485 Scopus Google ScholarのCrossRef ビューレコード 24 P. Cesare 、LV Dekker 、A. Sardini 、PJ Parker 、PA McNaughton 痛みを伴う熱に対するニューロンの反応の感作におけるPKC-εの特異的関与 ニューロン、23 (3 )(1999 )、PP。617 – 624 記事のダウンロードPDFを見るScopus Google Scholar 25年 L. Li 、R. Hasan 、X. Zhang TRPV1イオンチャネルの基礎熱感度は、PKCβIIによって決定されます。 J Neurosci 、34 (24 )(2014 )、頁8246 – 8258 Scopus Google ScholarのCrossRef ビューレコード 26 LS Premkumar 、GP Ahern プロテインキナーゼCによるvanilloid receptor channel活性の誘導 ネイチャー、408 (6815 )(2000 )、頁985 – 990 Scopus Google ScholarのCrossRef ビューレコード 27年 Y. 周、GD リー、ZQ 趙 炎症および神経損傷後の成体ラット後根神経節におけるプロテインキナーゼCのイプシロンアイソザイムの状態依存性リン酸化 J Neurochem 、85 (3 )(2003 )、pp。571 – 580 Scopus Google ScholarのCrossRef ビューレコード 28年 HL Pan 、YQ Zhang 、ZQ Zhao 後根神経節ニューロンにおけるPKCɛ経路を介したTRPV1の増強による骨癌性疼痛におけるリゾホスファチジン酸の関与 Mol Pain、6(2010)、p。85 記事のダウンロードPDF CrossRef Scopusでの記録を見るGoogle Scholar 29年 X. 張、J. 黄、PA マクノートン NGFは急速にTRPV1の熱依存性イオンチャネルの膜発現を増加させます EMBO J 、24 (24 )(2005 )、pp。4211 – 4223 Scopus Google ScholarのCrossRef ビューレコード 30 生理学的役割を理解するためのラット組織中のTRPV1タンパク質レベルの P. Han 、AV Korepanova 、MH Vos 、RB Moreland 、ML Chiu 、CR Faltynek 定量化 JモルNeurosci 、50 (1 )(2013 )、頁。23 – 32 Scopus Google ScholarのCrossRef ビューレコード 31 J. ユング、JS シン、SY リー、SW ファン、J。 クー、H。 チョ、他。 Ca 2+ /カルモジュリン依存性キナーゼII によるバニロイド受容体1のリン酸化はそのバニロイド結合を調節する J Biol Chem 、279 (8 )(2004 )、pp。7048 – 7054 Scopus Google ScholarのCrossRef ビューレコード 32 カルシニューリンおよびcAMP依存性プロテインキナーゼによるバニロイド受容体TRPV1におけるCa 2+依存性脱感作の DP Mohapatra 、C. Nau 規制 J Biol Chem 、280 (14 )(2005 )、pp。13424 – 13432 Scopus Google ScholarのCrossRef ビューレコード 33 CE コンスタンタン、N. Mairの、CA ザイラー、M. Andratsch 、ZZ 徐、MJ Blumer 、ら。 マウス癌モデルにおいて内因性腫瘍壊死因子アルファ(TNFα)は熱痛覚過敏を発生させるためにTNF受容体2型を必要とする J Neurosci 、28 (19 )(2008 )、pp。5072 – 5081 Scopus Google ScholarのCrossRef ビューレコード 34 S. 折田、T. 石川、M. 宮城、N. 落合、G. 井上、Y. 江口、ら。 炎症性疼痛に加えて神経損傷を徐々に発症するラット膝におけるモノヨードアセテート誘発性変形性関節症における疼痛関連感覚神経支配 BMC Musculoskelet Disord 、12 (2011 )、pp。134 – 145 Google Scholar 35 S. Mandadi 、T. 富永、M. Numazaki 、N. 村山、N. 斎藤、PJ Armati 、ら。 PMAによる脱感作TRPV1の感度の増加はS800でPKCepsilonを介したリン酸化を介して発生します 疼痛、123 (1-2 )(2006 )、頁106 – 116 記事のダウンロードPDF CrossRef Scopusでの記録を見るGoogle Scholar 36 KO Aley 、RO メッシング、D. Mochly・ローゼン、JD レヴァイン プロテインキナーゼCの電子アイソザイムによって媒介炎症性侵害受容器の感作のための慢性過敏症 J Neurosci 、20 (2000 )、pp。4680 – 4685 Scopus Google ScholarのCrossRef ビューレコード 37 SG Khasar 、YH 林、A. マーティン、J. Dadgar 、T. マクマホン、D. ワング、ら。 プロテインキナーゼC e変異マウスで明らかにされた新規侵害受容体シグナル伝達経路 ニューロン、24 (1999 )、PP。253 – 260 記事のダウンロードPDFを見るScopus Google Scholar 38 I. レディース、JM Tavaré 、RM デントンは、 プロテインキナーゼC阻害剤は、I(GFの109203x)およびIX(RO 31-8220)は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ-3活性の強力な阻害剤であるビスインドリルマレイミド FEBS Lett 、460 (3 )(1999 )、pp。433 – 436 記事のダウンロードPDF CrossRef Scopusでの記録を見るGoogle Scholar 39 PB ヤコブソン、SL Kuchera 、A. メス、C. Schächtele 、K. イムレ、DJ Schrier GO 6850の抗炎症特性:プロテインキナーゼCの選択的阻害剤 J Pharmacol Exp Ther 、275 (2 )(1995 )、pp。995 – 1002 Scopus Google Scholarでレコードを表示する 40 HC Fan 、X. Zhang 、PA McNaughton TRPV4イオンチャンネルの活性化はリン酸化によって促進される J Biol Chem 、284 (41 )(2009 )、pp。27884 – 27891 Scopus Google ScholarのCrossRef ビューレコード 41 G. Bhave 、W. 朱、H. 王、DJ Brasier 、GS オックスフォード、RW Gereau 4 cAMP依存性プロテインキナーゼ直接リン酸化によりカプサイシン受容体(VR1)の脱感作を調節します ニューロン、35 (2002 )、頁721 – 731 記事のダウンロードPDFを見るScopus Google Scholar 42 I. フェッター、W. チェン、M. Peiris 、BD ワイズ、SJ ロバーツ-トムソン、J. 鄭、ら。 一過性受容体電位バニロイド1感作に関与する迅速なオピオイド感受性機序 J Biol Chem 、283 (28 )(2008 )、pp。19540 – 19550 Scopus Google ScholarのCrossRef ビューレコード 43 K. Schnizler 、LP Shutov 、MJ ヴァンKanegan 、MA メリル、B. ニコルズ、GS マクナイト、ら。 AKAP150を介した蛋白質キナーゼA固定はマウス感覚ニューロンにおけるホルスコリンとプロスタグランジンE 2によるTRPV 1調節に必須である J Neurosci 、28 (19 )(2008 )、pp。4904 – 4917 Scopus Google ScholarのCrossRef ビューレコード 44 PS Puttfarcken 、P. ハン、SK ジョシ、TR Neelands 、DM Gauvin 、SJ ベーカー、ら。 A − 995662 [(R)−8−(4−メチル−5−(4−(トリフルオロメチル)フェニル)オキサゾール−2−イルアミノ)−1,2,3,4−テトラヒドロナフタレン−2−オール)、ラット膝関節痛モデルにおいて選択的TRPV1受容体拮抗薬はグルタミン酸塩とCGRPの脊髄放出を減少させる Pain 、150 (2 )(2010 )、pp。319 – 326 記事のダウンロードPDF CrossRef Scopusでの記録を見るGoogle Scholar 45 S. ワング、J. ジョセフ、JY Roを、MK チョン TRPV1のプロテインキナーゼCにより誘導される過敏症のモダリティ固有のメカニズム:S800は、多感作部位であります Pain 、156 (5 )(2015 )、pp。931 – 941 Scopus Google ScholarのCrossRef ビューレコード 46 Y. 杉本、Y. 小島、A. 稲吉、K. 井上、H. 三浦日下、K. 森、ら。 ラット完全フロイントアジュバントモデルにおいてTRPV1拮抗薬K ‐ 685はPKC感作TRPV1活性化を遮断し炎症性疼痛を改善する J Pharmacol Sci 、123 (3 )(2013 )、pp。256 – 266 Scopus Google ScholarのCrossRef ビューレコード ある この作品にも同様に貢献しました。 ©2016変形性関節症研究協会インターナショナル。エルゼビア株式会社発行 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1063458416010438