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概要
目的
関節内注射されたヨード酢酸モノナトリウム(MIA)は、変形性関節症(OA)を模倣する関節病理を誘発し、そしてそれはOAの広く使用されている実験モデルである。MIAは急性炎症、軟骨劣化および関節痛を誘発する。一過性受容体電位 アンキリン1(TRPA1)は、侵害受容および神経性炎症を媒介することが知られているイオンチャネルである。ここでは、TRPA1がMIA誘発性の急性炎症、軟骨変化および関節痛の発症に関与するという仮説を検証した。
方法
薬理学的遮断(TCS 5861528による)およびTRPA1の遺伝的枯渇の影響をMIA誘発急性足炎症において研究した。MIA誘発実験的OAにおける軟骨変化(組織学的採点)および関節痛(体重負荷試験)を野生型マウスとTRPA1欠損マウスとの間で比較した。MIAの効果はまた、初代ヒトOA軟骨細胞およびマウス軟骨において研究された。
結果
MIAは、野生型マウスにおいて急性炎症、変性軟骨変化および関節痛を誘発した。興味深いことに、これらの反応はTRPA1欠損動物において減弱した。MIA誘発性の足の炎症はサブスタンスPの組織レベルの上昇と関連していた。炎症性浮腫は、カタラーゼ、TRPA1拮抗薬TCS5861528およびニューロキニン1受容体拮抗薬L703,606で前処理することによって減少した。軟骨細胞において、MIAはインターロイキン-1 誘導シクロオキシゲナーゼ-2(COX-2)発現を増強したが、これは薬理学的阻害およびTRPA1の遺伝的枯渇によって鈍くなった効果である。
結論
TRPA1は、マウスのMIA誘発実験的OAにおいて急性炎症ならびに変性軟骨変化および関節痛の発生を媒介することが見出された。結果は、OAにおける潜在的なメディエータおよび薬物標的としてのTRPA1を明らかにする。
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キーワード
TRPA1ヨード酢酸ナトリウム誘発性変形性関節症炎症関節痛COX-2
前書き
変形性関節症(OA)は、世界的に最も一般的な関節疾患であり、その罹患率は人口の高齢化とともに増加しています。この疾患は、様々な関節の炎症に関連し、痛みおよび関節機能の喪失、そして最終的には関節置換手術の必要性を示す関節軟骨の劣化を特徴とする。1、2
関節腔へのヨード酢酸モノナトリウム(MIA)の注射は、ヒトOAに見られるものを模倣する関節病理を誘発し、それはOAの実験モデルとして広く使用されている3。MIAは、ローカル急性炎症誘発4、5 に退行性変化の開発が続いて関節軟骨を、痛覚過敏および減少体重負荷を示す患肢に関節痛 3、6。OAの状況と同様に、MIA誘発実験的OAの発症と調停に関連する詳細なメカニズムは完全には解明されていない。細胞レベルでは、MIAは活性酸素種(ROS)の生成とカスパーゼ活性化を誘導するグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼの阻害剤として認識されています7。
一過性受容体電位 アンキリン1(TRPA1)に関与するイオンチャネル痛覚および神経性炎症は、最近、痛みと炎症状態治療するための潜在的な薬物標的として大きな関心を集めている 8、 9、 10。種々のにインビボでモデル、TRPA1の活性化は、炎症性浮腫の誘発に重要であることが証明されている 11、痛覚過敏 12及び痛み 13、 14。膜結合TRPA1の活性化はカチオン、特にCa 2+の流入を引き起こす侵害受容および炎症誘発性ニューロペプチド サブスタンスP、カルシトニン遺伝子関連ペプチドおよびニューロキニンA9の放出などのTRPA1の活性化の細胞応答を媒介する。TRPA1は、リガンド依存性チャネルであり、その生理的役割は、次のような環境の潜在的に有害な化合物の化学センサーとして作用すると考えられているイソチオシアン酸アリルカラシ油中の辛味化合物の存在と広くTRPA1活性化するための研究ツールとして使用する(AITC)10を、 15 。環境刺激物に加えて、多くの内因的に形成された過酸化水素(H2O2)16、一酸化窒素17およびニトロオレイン酸18はTRPA1を活性化することが証明されている。
MIAがROSの産生を誘導するという証拠、およびROSが最も強力な内因性TRPA1活性化因子の一部であるという証拠に基づいて、我々はTRPA1活性化がMIA誘導実験的OAにおける炎症および炎症性疼痛の発症に関与し得ると仮定した。以前に、MIA誘導性OAにおけるTRPA1の役割を調べる2つの報告が公表されている。これらの研究では、単回用量のTRPA1のアンタゴニストは、疼痛様挙動を変更するため、または体重を支える移行に失敗した6処置は、機械的に誘起過敏遮断するのに有効であったが、 19。しかしながら、我々は、TRPA1がMIA誘発性急性炎症において役割を果たし、それ故MIA誘発性関節炎の発症に寄与し得ると仮定した。本研究では、TRPA1活性化がMIA誘発性急性炎症性浮腫およびシクロオキシゲナーゼ-2(COX-2)発現、ならびに軟骨変化および関節の発達を増強/媒介できるかどうかを調べるために、TRPA1の薬理学的遮断および遺伝的枯渇の両方を利用した。MIA誘発実験的OAに特徴的な疼痛。
材料および方法
動物たち
野生型およびTRPA1 ノックアウト男性B6。129P − Trpa1(tm1Kykw)/ Jマウス(Charles River Laboratories、Sulzfeld、Germany)をTRPA1の遺伝的枯渇の影響を調べる実験に使用した。野生型雄性C57BL / 6Nマウス(Scanbur Research A / S、カールスルンデ、デンマーク)を用いて薬物の効果を研究した。マウスを標準的な条件下(12〜12時間の明暗周期、22±1℃)で飼料および水を自由に与えて飼育した。動物実験は、科学目的で使用される動物の保護に関する法律(指令2010/63 / EU)に従って実施され、国立動物実験委員会によって承認された。腹腔内注射のメデトミジン(0.5ミリグラム/ kgで、Domitor ® 、オリオンOyjの、エスポー、フィンランド)およびケタミン(75ミリグラム/ kgのケタラール® 、ファイザーオイ動物衛生、ヘルシンキ、フィンランド)を達成するために使用された麻酔。実験後、動物を一酸化炭素とそれに続く頭蓋脱臼により屠殺した。特に明記しない限り、試薬は、米国ミズーリ州セントルイスのシグマケミカル社から購入した。
研究動物グループ
野生型マウスに選択的TRPA1拮抗薬TCS5861528(経口的に10mg / kg)、抗炎症ステロイド デキサメタゾン(腹腔内に2mg / kg)、過酸化水素分解酵素カタラーゼ(300IU /足内足底)を 投与した。実験前にニューロペプチド物質P20またはビヒクル(PBS腹腔内)の作用を遮断することが示されているニューロキニン1受容体拮抗薬L703,606(腹腔内に10mg / kg、Enzo Life Sciences AG、Lousen、スイス)。経口投与薬は75%ポリエチレングリコールで希釈した実験の2時間前に250μlの容量で強制飼養により与えた。腹腔内投与した薬物を450μlの容量になるようにPBSで希釈し、そして実験の1時間前に投与した。足底内投与薬をPBSで希釈し、MIAと同時に投与した。さらに、TRPA1の遺伝的枯渇の影響を、TRPA1ノックアウトマウスおよびそれらの対応する野生型対応物における応答を比較することによって研究した。
炎症性足浮腫検査
炎症性足浮腫を、50μlの滅菌0.9%NaCl中に希釈したMIA(400μg)を、麻酔をかけたマウスの後足に注入することによって誘発した。反対側の足にビヒクルを注射したところ、測定可能な浮腫は見られなかった。足容積を、プレチスモメーター(Ugo Basile、Comerio、イタリア)を用いて6時間まで測定し、ベースライン値と比較した。
足の組織抽出とサブスタンスPの測定
マウスを屠殺した後、MIAを注射した炎症を起こした皮下足組織および反対側の皮下足組織を、トリス(50mM、pH7.4)、NaCl(150mM)、0.5%トリトンを含有する緩衝液中に分析のために集めた。−Xならびにプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤、フェニルメチルスルホニルフルオリド(0.5mM)、オルトバナジン酸ナトリウム(2mM)、ロイペプチン(0.10μg / ml)、アプロチニン(0.25μg / ml)およびNaF(1.25mM)。組織を細かく刻み、溶解緩衝液中で20分間、絶えず激しく振盪しながらインキュベートした。サンプルを遠心分離し、10で 000 gで10分間静置し、上清を回収し、ELISA(R&D Systems Europe Ltd.、Abingdon、UK)によってサブスタンスPについて測定した。
自発体重負荷テスト
MIA誘発性関節炎は、40μlの無菌エンドトキシンを含まないPBSで希釈したMIA(500μg)を麻酔したマウスの無作為化後膝関節に注射することによって誘発した。反対側の膝関節に対応する量のビヒクルを注射した。罹患関節(自発的に重量を負担する意志体重負荷試験)は、無力容量計(IITC Life Science、米国カリフォルニア州ウッドランドヒルズ)を用いて28日間まで測定し、ベースライン値と比較した。測定前にマウスを測定室に60分間慣れさせ、その後の測定をその日の同じ時間に行った。体重分布に関する信頼できるデータを得るために、各マウスを各時点で1秒間8回測定し、測定者は患肢を盲検にした。
組織学的分析
MIA誘導性OAを上記のように誘導した。28日目にマウスを屠殺し、MIAおよびビヒクルを注射した膝関節を10%ホルムアルデヒドで24時間解剖して固定し、48時間オステオモール(メルク、ダルムシュタット、ドイツ)で脱灰し、パラフィンに包埋した。大腿骨 – 脛骨関節の冠状切片(厚さ5μm)を段階的な一連のエタノール中で再水和し、サフラニン-O-ファストグリーンで染色した。軟骨の変更はOARSIガイドラインに従って採点した 21の処理とを知らされた2人の独立した観察者によって遺伝子型。
ヒト軟骨細胞培養および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)測定
膝関節置換手術からの残りのOA軟骨片は、フィンランドのタンペレにあるタンペレ大学病院の倫理委員会による完全な患者の同意および承認の下で使用された。補足データに記載されているように軟骨細胞を単離し培養した。軟骨細胞をMIA(100μM)、TRPA1拮抗薬HC - 030031(100μM)、IL - 1β(100pg / ml、R&D Systems Europe Ltd.)と6時間インキュベートし、RT - 4により分析した。補足データに記載されている通りのCOX-2発現のためのPCR 。
マウス軟骨培養およびウエスタンブロッティング測定
大腿骨頭からの全層関節軟骨を補足データに記載のように培養した。軟骨片をMIA(10μM)、TRPA1拮抗薬HC − 030031(100μM)、IL − 1β(100pg / ml、R&D Systems Europe Ltd.)または24時間これらの薬剤の組み合わせにさらした。補足データに記載されているようにウエスタンブロッティングによりCOX - 2について分析した。
Ca 2+流入測定
以前に記載されたように、TRPA1媒介Ca2+流入を、ヒトTRPA1を一過性にトランスフェクトしたHEK 293細胞22において測定した11。簡潔には、培養細胞は、フルオ-3アセトキシメチルエステル(4μM)と0.08%を充填したプルロニック F-127 ® ハンクスで平衡塩溶液(HBSS)の1mg / mlの含有ウシ血清アルブミン、プロベネシド(2.5mMの)と室温で30分間HEPES(25mM、pH7.2)。細胞内遊離Ca 2+レベルは、535分の485 nmでの励起/発光波長でVictor3 1420マルチラベルカウンター(パーキンエルマー社、ウォルサム、MA、USA)を用いて評価した23。実験では、細胞を最初にTRPA1アンタゴニストHC - 030031(100μM)またはビヒクルと一緒に+ 37℃で30分間プレインキュベートした。その後、MIA(100μM)またはAITC(50μM)を添加し、測定を30秒間続けた後、対照イオノフォア化合物であるイオノマイシン(1μM)を適用することにより、頑強なCa2+流入を誘導した。
統計分析
結果は平均±95%信頼区間として表される。データをSPSS 21ソフトウェア(SPSS Inc、シカゴ、イリノイ州、米国)を用いて分析した。使用した試験は図の説明文に詳述されている。
結果
MIAはTRPA1依存的に急性炎症反応を誘発する
マウス足へのMIAの注射は、図1(A) – (C)に見られるように急性炎症性浮腫を誘発した。興味深いことに、選択的TRPA1拮抗薬TCS5861528による処置は浮腫の形成を有意に減少させ(3時間および6時間の時点でそれぞれ45%および46%の阻害;図1(A))、この反応は以下を介して媒介されたことを示唆する。TRPA1の活性化。MIA誘発性足浮腫におけるTRPA1の関与を証明する我々は、TRPA1欠損マウスと対応する野生型マウスとの間の応答を比較した。TRPA1アンタゴニストを用いて得られた結果の確認において、MIA誘導性炎症性浮腫は、野生型マウスと比較してTRPA1欠損マウスにおいて有意に減少し、3時間で58%低い応答および6時間で63%の減少を示した[図3]。 1(B)]。
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図1。MIA誘発急性足浮腫は、TRPA1の遺伝的枯渇および薬理学的阻害の両方によって、ならびに過酸化水素解毒酵素カタラーゼおよびニューロキニン1受容体拮抗薬による治療によっても阻害された。マウス後足に注射したときにMIAが急性炎症性浮腫を誘発した。TRPA1アンタゴニスト、TCS 5861528(10mg / kg)による処置は、MIA誘発マウス足浮腫を有意に阻害した(A)。同様に、TRPA1欠損(ノックアウト)マウスは、対応する野生型マウスと比較してMIAに応答して浮腫の軽減を発症した(B)。さらに、過酸化水素解毒酵素、カタラーゼ(300IU /足)およびニューロキニン1受容体拮抗薬、L703,606(10mg / kg)による治療は、TRPA1による治療と同様にMIA誘発性浮腫(C)の発症を抑制した。アンタゴニストTCS 5861528.管理グルココルチコイドデキサメタゾン 抗炎症性対照化合物として使用される(2mg / kg)もまたMIA誘導性炎症性浮腫を抑制した(C)。MIA注射の前および3および6時間後に足容積をプレチスモメータで測定した(400μgを40μlの内毒素を含まないリン酸緩衝食塩水に溶解した)。MIA(エンドトキシンを含まないリン酸緩衝食塩水)の溶媒を注射した反対側の対照足は、測定可能な浮腫を発症しなかった。足浮腫は処置前の値と比較した容積変化として表し、結果は平均+ 95%信頼区間として表示され、AおよびCでは1群あたり8匹の動物が存在し、Bでは1群あたり6匹の動物が存在した。データを一元配置分散分析、続いてボンフェローニの多重比較検定で分析した。
動物を過酸化水素分解酵素カタラーゼで処置することによって、MIA誘発急性炎症性浮腫の根本的な機序を最初に調べた。MIAは、ROSの産生誘導するという事実に基づいて7もTRPA1活性化することが知られている10、16、我々は、過酸化水素の生成がMIAの注射によって誘発される炎症反応を媒介することができると仮定しました。興味深いことに、図1(C)に見られるように、カタラーゼはMIA誘発足浮腫の明らかな減少を引き起こした(それぞれ3時間および6時間の時点で48%および49%の阻害)。
TRPA1の活性化の炎症効果は、しばしばの放出によって説明される神経ペプチド、特にサブスタンスP、および神経性炎症の促進9、 10 。そこで、ニューロキニン1受容体拮抗薬 L703,606 20を用いて、サブスタンスPに対する受容体遮断の効果を調べた。図1(C)に見られるように、L703、606による処置は、3時間の時点でMIA誘発足浮腫を42%および6時間の時点で36%阻害した。さらに、MIAは、図2(A) – (B)に示すように炎症を起こした足の組織中のサブスタンスPレベルの増加を誘導し、そしてこの増加はTRPA1ノックアウトにおいて減弱した。マウス[ 図2(A) ]。したがって、TRPA1拮抗薬TCS 5861528による前処理は、予想されるように、MIA誘発性のサブスタンスPレベルの増加を減少させたが、L703,606は効果がなかった[図2(B)]。
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図2。MIA は、炎症を起こした足へのニューロペプチド物質Pの放出を誘導した。この効果は、TRPA1の遺伝的枯渇および薬理学的阻害の両方によって阻害されたが、ニューロキニン1受容体アンタゴニストによる治療によっては阻害されなかった。サブスタンスP濃度は、MIAの注射後にマウスの足において上昇した。興味深いことに、サブスタンスPの放出は、対応する野生型マウスと比較してTRPA1欠損(ノックアウト)マウスにおいて低かった(A)。同様に、TRPA1拮抗薬TCS 5861528(10mg / kg)による治療はサブスタンスPの放出を阻害したが、ニューロキニン1受容体拮抗薬はL703,606(10 mg / kg)の効果はごくわずかです(B)。研究したマウスの罹患した足にMIA(40μlの内毒素を含まないリン酸緩衝食塩水に溶解した400μg)を注射したが、反対側の対照足には溶媒(内毒素を含まないリン酸緩衝食塩水)を注射した。6時間後、マウスを屠殺し、そして収集した足の組織サンプルをELISAによりサブスタンスP濃度について分析した。結果は平均+ 95%信頼区間として表示され、(A)群あたり6匹の動物が存在し、(B)群あたり8匹の動物が存在した。データを一元配置分散分析、続いてボンフェローニの多重比較検定で分析した。
MIAは軟骨細胞においてTRPA1依存的にCOX-2発現を誘導する
TRPA1の活性化は、いくつかの細胞型で誘導性プロスタグランジンシンターゼ、COX-2 の発現を増強することが報告されています11。MIAはまた、OAの関節のCOX-2の発現増加することが見出されている24、25 。したがって、我々は、上記のパターン(すなわち、TRPA1がMIA誘導性急性炎症性浮腫を媒介すること)も、COX - 2発現に焦点を合わせて、ヒト軟骨細胞におけるMIA誘導性応答に拡張できるかどうかを調査することにした。
OA患者由来の初代軟骨細胞を培養し、RT-PCRを用いてTRPA1がこれらの細胞に発現していることを確認した。次に、本発明者らは、軟骨細胞をMIA、選択的TRPA1アンタゴニストHC-030031、またはインターロイキン-1β(IL-1β)刺激の有無にかかわらずそれらの組み合わせで処理した。MIAまたはHC-030031単独ではCOX-2発現を変化させなかった。それにもかかわらず、MIAはIL-1β刺激軟骨細胞におけるCOX-2発現を明らかに増加させた。さらに、TRPA1アンタゴニストHC − 030031による処置は、図3(A)に示されるように、MIA誘発性のCOX − 2発現の増加を無効にした。
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図3。MIA誘導性COX - 2発現は、TRPA1の薬理学的阻害および遺伝的枯渇によって減少した。初代培養ヒト変形性関節症の軟骨細胞、TRPA1を用いた治療アンタゴニスト HC-030031は、によって誘導される炎症促進性遺伝子COX-2の発現低下共刺激MIA及びIL-1β(A)とします。対応して、マウス由来の軟骨において、MIAは、野生型からのIL-1β刺激軟骨におけるCOX-2発現を増加させたが、TRPA1欠損(ノックアウト)マウスからは増加させなかった(B)。試料を試験化合物と共に6時間培養し、COX-2 mRNAについて分析した。RT - PCR(A)または24時間発現させ、ウエスタンブロッティング(B)によりCOX - 2タンパク質発現について分析した。mRNA発現はハウスキーピング遺伝子GAPDH(A)に対して、そしてタンパク質発現はローディングコントロールアクチン(B)に対して標準化した。IL - 1β処理軟骨細胞/軟骨における応答は100%に設定され、他の結果はその値に関して計算された。結果は平均+ 95%信頼区間として表示されます。ヒト試料は6人の異なるドナーから得られ、実験は3回行われた(A)。軟骨サンプルは 各処置(BおよびC)において5匹のマウス(n= 5)からのものであった。一元配置分散分析を用いたSPSSソフトウェアでデータを分析した。 Bonferroniの多重比較検定が続きます。
上記の知見は、MIAがTRPA1媒介様式でOA軟骨細胞においてCOX-2発現を誘導できることを示唆している。その過程におけるTRPA1のメディエーターの役割は、野生型およびTRPA1欠損マウス由来の関節軟骨におけるCOX − 2発現を決定することによって解明された。初代ヒトOA軟骨細胞において得られた知見を支持して、MIAは、野生型由来のIL - 1β刺激軟骨におけるCOX - 2発現を増加させた[図3(B)]が、TRPA1ノックアウト由来ではない[図3(C)]]マウス、そしてさらに野生型マウスでは、MIAの効果はTRPA1アンタゴニストHC-030031により阻害された[図3(B)]。
TRPA1欠損マウスにおけるMIA誘発性関節痛および軟骨変化の減弱
急性炎症の結果として、軟骨劣化および関節痛の発症は、MIA誘発性OAにおいて遭遇する特徴的な特徴である。後者は、通常、いわゆるにインキャパシタンス計により測定される体重支持テスト 3、 6。TRPA1は、神経障害性および炎症性疼痛の様々な形媒介することが報告されているように 9、 10を我々は、TRPA1がMIA誘導性関節痛の発症にも関与しているかどうかを調べた。MIAを片方の膝関節に注射した場合、野生型マウスは罹患関節で自発体重負荷の減少を示し、これは関節痛を示している。興味深いことに、図4(A) – (B)に見られるように、弱毒化反応がTRPA1欠損マウスにおいて検出され、TRPA1が実際にMIA誘導性OAに典型的な関節痛の発生に関与していることを示唆する。さらに、OARSIガイドライン21によると、軟骨におけるMIA誘導性の組織学的変化のスコアは、野生型マウスよりもTRPA1欠損において低かった(図5)。
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図4。TRPA1欠損マウスは、体重負荷試験においてMIAに対して減弱した反応を示し、関節痛の軽減を示した。MIAを片方の膝関節に注射した場合、野生型マウスは、関節痛を示す罹患肢の自発体重負荷の減少を示した。興味深いことに、TRPA1欠損(ノックアウト)マウスにおいて体重分布の変化の減弱が見られた。重量の自然分布後肢は、前インキャパシタンス計で測定した 7において、14および28日MIAの関節内注射後(500μgの40μlの中に溶解させ、エンドトキシン遊離リン酸緩衝食塩水)。反対側の膝関節にMIA(エンドトキシンを含まないリン酸緩衝生理食塩水)の溶媒を注射し、測定者は罹患肢について盲検化した。(A)において、結果は、罹患および非罹患肢による重量ボアとの間のパーセントポイントの差として表示され、平均値±95%信頼区間として与えられ、 N 野生型およびTRPA1欠損群における7匹の動物を=。被験者間分散分析ANOVAを用いてデータを分析し、2つの遺伝子型の間に統計的に有意な差が見られた( P = 0.045)。(B)において、後肢間の均等なバランスからのシフトについての曲線下面積(AUC)を計算し、そして野生型およびTRPA1欠損マウスの結果を平均+ 95%信頼区間、nとして示す。 =野生型およびTRPA1欠損群の7匹の動物。対応のないT検定を用いてデータを分析したところ、2つの遺伝子型の間に統計的に有意な差が見られた(P = 0.041)。
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図5。TRPA1欠損マウスは、MIA注射後に膝関節に軽度の軟骨変化を発症した。MIAを膝関節に注射した場合、野生型マウスはTRPA1欠損(ノックアウト)マウスよりも重度の軟骨変化を示した。片方の膝関節にMIA(内毒素を含まないリン酸緩衝生理食塩水40μlに溶解した500μg)を反対側の関節にMIA(内毒素を含まないリン酸緩衝生理食塩水)の溶媒で関節内注射した28日後。屠殺し、そして膝関節を組織学のために解剖した。軟骨の変化はOARSIガイドラインに従って採点された。(A)では、全関節組織病理学的スコアが提示されている。結果は平均+ 95%信頼区間、n として表示されます。 =野生型およびTRPA1欠損群の7匹の動物。Bonferroniの多重比較検定を用いた一元配置分散分析を使用して、SPSSソフトウェアでデータを分析した。(B)では、野生型およびTRPA1欠損(ノックアウト)マウスからのMIA注射およびビヒクル注射(対照)対側膝関節の代表的な図を示す。切片をサフラニン-O-ファストグリーンで10倍に染色した。
MIAはTRPA1イオンチャンネルの直接活性化因子ではない
MIAが誘発する反応の多くはTRPA1を介して媒介されることがわかったので、MIAがTRPA1イオンチャネルの直接の活性化因子であり得るかどうかを質問した。その可能性を調べるために、MIAをTRPA1でトランスフェクトしたHEK 293細胞に導入した。MIAは試験細胞への Ca 2+流入を誘導しなかったが、既知のTRPA 1アゴニストAITCは強いCa 2+流入を誘導したが、これは図6に見られるようにTRPA 1アンタゴニストHC-030031による処理によって阻害することができた。これらのデータは、MIAが直接TRPA1アゴニストではないが、本研究で発見されたMIAのTRPA1媒介効果の原因である内因性TRPA1活性化因子の放出を誘導する可能性が最も高いことを示している。
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図6。MIAは、TRPA1をトランスフェクトしたHEK293細胞へのTRPA1媒介Ca2+流入を誘導しなかった。MIAは、TRPA1媒介Ca2+流入(A)を誘発しなかったが、既知のTRPA1アゴニストAITCは、選択的TRPA 1拮抗薬HC - 030031(C)による前処理によって阻害された頑強なCa2+流入(B)を誘導した。。HEK293細胞をTRPA1をコードするプラスミドでトランスフェクトし、そして方法に記載したようにしてFluo −3AMを負荷した。細胞内Ca 2+濃度は、1 / s周波数で485 / 535nmの励起/発光波長でVictor3マルチラベルカウンターにより測定した。細胞を最初にHC-030031(100μM)(C)またはビヒクル(A-B)と共に+ 37℃で30分間プレインキュベートしました。実験(A〜C)では、最初に15秒間基礎蛍光を測定し、その後100μMのMIA(A)または50μMのAITC(B〜C)を添加し、その後30秒間1μM測定を続けた。対照イオノフォア化合物であるイオノマイシンを細胞に導入した。結果を背景に対して正規化し、平均値(濃い灰色の線)±95%信頼区間(薄い灰色のシャドーイング)、n = 6として表した。
討論
本研究は、MIA誘発性急性炎症がTRPA1欠損マウスにおいて、ならびにTRPA1 拮抗薬TCS 5861528、ニューロキニン1受容体拮抗薬 L703,606およびH 2 O 2 分解酵素カタラーゼによる治療によって減少することを明らかにした。我々はまた、対応する野生型マウスと比較した場合、MIAを注射した肢からの自発的体重移動がTRPA1欠損マウスにおいて減弱することを証明した。さらに、MIA誘発軟骨変化はTRPA1欠損マウスではそれほど深刻ではなかった。これらの結果は共に、TRPA1イオンチャネルがMIA誘発性急性炎症、軟骨変化および関節痛の発症に大きく関与しています。
もともとTRPA1は1999年26に胎児の肺線維芽細胞で記述されました。その後、TRPA1がAδおよびC線維のような異なる求心性感覚ニューロンにおいて発現されることが示された27。また、実質的に非ニューロン発現およびTRPA1の機能は、以下のような裏打ち細胞において同定されたケラチノサイト、滑膜細胞および内皮細胞10、28。TRPA1の生理学的役割は、外因性刺激及び有害化合物の検出であると考えられたが、TRPA1はまた、炎症促進する能力を有することが蓄積した証拠があるれている9、10。TRPA1は、炎症性浮腫の開発のために重要であることが証明されている11痛覚過敏、12及び痛み13、14そのような気道過敏性および炎症などの病的状態では29、30、急性痛風性関節炎31及び神経性炎症性大腸炎に関連付けられている32。TRPA1が内因的に形成された活性酸素および窒素種ならびにそれらの代謝産物16によって活性化されるという事実に加えて、TRPA1はいくつかの二次メッセンジャー、すなわちホスホリパーゼCおよびプロテインキナーゼAによっても感作される。33 種々の炎症誘発によって活性化される、メディエーターその貫通Gタンパク質共役型受容体。TRPA1の活性化は、主に導く痛覚の放出促進することにより神経性炎症の増幅神経ペプチドなどのサブスタンスPおよびカルシトニン遺伝子関連ペプチド9、 10 。さらに、TRPA1活性化後の他の多くの二次炎症メカニズムが同定されている。例えば、TRPA1活性化によって引き起こされる炎症性浮腫は、肥満細胞の脱顆粒、好中球の遊走、ヒスタミンの放出などの機序によって媒介される。、セロトニン及びアドレナリンならびにプロスタグランジンの産生 11、34。また、TRPA1の活性化のような炎症性遺伝子の発現を増強することが示されているプロスタグランジン産生酵素COX-2、ミエロペルオキシダーゼおよびIL-1β11、35、36、37。
それはヒトの疾患の組織学的および病態生理学的機能に似た変更トリガとして、齧歯類の膝関節へのMIAの注射は、OAを研究するために広く使用されている実験モデルである38、39、40、41 。さらに、数週間以内に痛みのような行動が見られます。これは一般により評価された体重支持テスト38、39、41 。MIAの作用機序は、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼの阻害に起因している。これは軟骨細胞のグルコース代謝を混乱させ、ROS産生とカスパーゼを導く活性化、およびさらに異化軟骨マトリックスとの両方を検出することができる、細胞死の in vivoでおよび in vitroで7、 38、 42、 43 。軟骨分解を誘発することに加えて、MIAは浮腫形成およびIL-1β、IL-6、IL-15 、誘導型一酸化窒素シンターゼ(iNOS)、COX-2 などの炎症誘発因子の発現増加に関連する急性炎症を誘発する。メタロプロテイナーゼ13 24、 25 。興味深いことに、MIAはまた、ニューロペプチド、サブスタンスP、およびPの早期放出を引き起こすことが実証されています。カルシトニン遺伝子関連ペプチド44。
MIA誘導性炎症および軟骨変化におけるTRPA1の役割はこれまで知られていなかったが、疼痛に焦点を当てているが、MIA誘導性OAにおけるTRPA1を調査した2つの研究がある。不思議なことに、単回投与直前の測定値に所定のTRPA1アンタゴニストは、疼痛様挙動を変更又は関節炎の後の段階で体重負荷試験における任意の変化を引き起こすことができなかった6が、それは、機械的に誘発される過敏遮断するのに有効であった19。しかしながら、これらの研究は主にTRPA1の活性化により仲介される有害な神経信号および疼痛に焦点を合わせていたが、それらは急性炎症またはTRA1の関節疼痛またはMIAにより誘発される軟骨変化の発生に対する長期効果を調べなかった。本研究では、TRPA1の活性化をMIA誘導性の急性炎症および軟骨変化の形成に結び付けることができ、そしてまた、TRPA1ノックアウトマウスにおいて関節痛の軽減を反映した体重移動の減少を観察した。
本結果は、MIA誘発性急性炎症性足浮腫がTRPA1活性化に依存していたことを実証している。遺伝的枯渇とTRPA1の薬理学的阻害の両方が浮腫の軽減に非常に効果的でした。さらに、浮腫の程度は、過酸化水素解毒酵素カタラーゼによる処理によっても減少し、浮腫が過酸化水素に起因する可能性が高いことを示していた。浮腫形成はまた、ニューロキニン1受容体に拮抗する化合物であるL703,606による治療によっても逆転した。重要なことに、サブスタンスPの濃度が炎症を起こした足の組織においてアッセイされた場合、それらは野生型マウスと比較してTRPA1ノックアウトマウスにおいて減少することが見出された。 TRPA1アンタゴニストTCS5861528で処置したマウス、しかし予想通り、L703、606での処置はサブスタンスPのレベルを変化させなかった。本結果に基づいて、起こり得る一連の事象は、最初のMIAが標的におけるROSの形成を誘導することである。細胞; 第二に、ROSはTRPA1を活性化してサブスタンスPの放出をもたらす。第三に、放出されたサブスタンスPはニューロキニン1受容体を活性化して急性炎症反応を誘発する。MIAの関節内注射後数週間以内に、変性軟骨および関節痛の証拠を見ることができ、そしてこれらの応答の両方がTRPA1欠損マウスにおいて軽減されるように思われる。現在のデータに基づいて、 MIA誘発性急性炎症とそれに続くOA様変化との間の因果関係を提案することは魅力的であるが、それらの関連を明らかにするためにさらなる研究が必要とされるであろう。
古典的にはTRPA1の機能は主に感覚神経において研究されてきたが、TRPA1の非ニューロン発現および機能は現在明らかに認識されている28。本研究では、我々はOA患者由来のヒト初代軟骨細胞におけるTRPA1の発現を観察した。軟骨細胞に対するMIAの既知の影響を考慮して25我々は培養ヒト軟骨細胞におけるTRPA1の可能性のある効果を研究することを決めた。細胞をMIAおよびIL - 1βで刺激すると、炎症誘発性遺伝子COX - 2の発現が増加し、これはTRPA1アンタゴニストHC - 030031で処理することによって阻害することができた。結果は培養マウス軟骨における所見と平行していた。MIAは、野生型マウス由来のIL-1β刺激軟骨におけるCOX-2発現の明らかな増加を誘導したが、この効果はTRPA1欠損マウス由来の軟骨では見られなかった。これらの結果は、TRPA1トランスフェクトHEK 293個の細胞において以前得られたものと同等であった11これは、TRPA1の炎症誘発性がその神経機能によるものではないかもしれないことを示している。TRPA1活性化がいかにしてCOX - 2発現の増加をもたらすが、細胞内Ca2+レベルが関連しているのかを説明するメカニズムを推測することしかできない。TRPA1の活性化は、細胞内Ca上昇2+以前に報告されているように直接又はCOX-2を含む炎症性遺伝子の発現に間接的な影響のいずれかを有していてもよい濃度45、46、47。しかしながら、サブスタンスPが軟骨細胞で発現され、そしてこの神経ペプチドがそれらの機能を調節することは注目に値する48そしてそれ故に見られる効果は自己分泌シグナル伝達にも起因し得る。
我々が研究設定を拡大し、そして体重負荷試験を用いてMIA誘発性関節痛を分析したとき、我々は、疼痛反応がTRPA1欠損マウスにおいて減弱したことを見出した。これらの動物はマウスよりも下肢の間で体重分布に大きな変化を示すので、MIA誘発体重負荷試験はしばしばラットで行われ、これは本結果を解釈するときに考慮されるべきである。この制限にもかかわらず、マウスが唯一の利用可能なTRPA1欠損種であるため、マウスの使用は現在の研究において正当化された。ここで野生型マウスで報告された体重分布の変化は、このモデル49で以前に報告されたのと同様の大きさでした。が、病因MIA誘発性関節痛が十分に理解されていない、それが開始され、その後、MIAによって誘発される早期の炎症によって変更される可能性が3、49、現在の結果は明らかにTRPA1欠損マウスにおけるMIAに応じて減少し、急性炎症を示しました。関節炎は、全てがTRPA1を発現するニューロン、軟骨細胞および滑膜細胞を含む多くの細胞型を含み、その活性化は関節炎の病因を誘発または調節し得る。興味深いことに、ニューロペプチドは関節炎50に関与していることが知られており、例えばサブスタンスPの受容体、すなわちニューロキニン1受容体の発現は豊富である48。。したがって、サブスタンスPのような神経ペプチドの放出をもたらすTRPA1の活性化がOAの病因において役割を果たすことは明らかに可能である。
現時点では、OAの治療は鎮痛薬、運動、過体重の減少、そして最終的には関節置換術に基づいています。残念なことに、有効な疾患修飾薬は利用できません。本研究は急性炎症とMIA誘発実験的OAにおける軟骨変化と関節痛の発症の仲介に関与する因子としてTRPA1を紹介する。実験モデルはヒトOAの多くの特徴を模倣しているので、本結果はTRPA1がOAの病因においても中心的な役割を演じ、従って疾患修飾能力を有する鎮痛薬および抗炎症薬の新規標的を提供する可能性を提起する。
投稿者の投稿
LJMは研究の概念と設計、データの取得、分析と解釈に貢献し、原稿を作成しました。MHは、研究の構想と設計、およびデータの取得、分析、解釈に貢献しました。EN、PI、およびKVは、データの取得、分析、および解釈に貢献しました。RMNは、研究の構想と設計、およびデータの取得、分析、解釈に貢献しました。LLは、研究の構想と設計、そしてデータの分析と解釈に貢献しました。EMは研究を監督し、研究の構想と設計、そしてデータの分析と解釈に貢献しました。すべての作家は重要な知的内容のために原稿を批評的に修正することに貢献し、投稿のために原稿の最終版を承認しました。最初の著者LJM(lauri.j.moilanen@uta.fi)とそれに対応する著者EM(eeva.moilanen@uta.fi)が、作業開始から完成品まで、作業全体の完全性について責任を負います。
利益相反の声明
作者は利益相反を宣言しません。
資金計算書
この研究は、フィンランドのタンペレ大学病院の医学研究基金からの助成金によって支えられていました。フィンランドタンペレ結核財団。フィンランド医学協会デュオデシム、フィンランド。および関節リウマチ、フィンランドタンペレReumayhdistys患者の組織。資金提供機関は研究デザインには何の役割もありませんでした。データの収集、分析または解釈 原稿の執筆中。または原稿を出版用に提出することを決定した場合。
謝辞
私たちは、優れた技術支援をしてくれたMs Meiju Kukkonen、Salla Hietakangas、Terhi Salonen、そしてプロの言語編集をしてくれたMs HeliMäättä、そしてプロの言語編集をしたDr Ewen MacDonaldに感謝します。
付録A 。補足データ
以下は、この記事に関連する補足データです。
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