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抽象
慢性疼痛は、21世紀における主要な医学的課題の1つであり、世界人口の15億以上に影響を及ぼしています。様々な慢性疼痛状態の重なり合った異質な症状は診断を複雑にし、診断を改善しそして疾患機序を理解するためのより特異的なバイオマーカーの必要性を強調している。
我々はここで、既知の「痛み」遺伝子に関してヒトCSFに見られるタンパク質、および機能不全疼痛(線維筋痛症、FM)、炎症性疼痛(慢性関節リウマチ患者、RA)および半定量的に利用される非疼痛対照を有する患者のコホートにおいて調べた。患者のこれらのコホート間の定量的な違いを探求するために質量分析法(MS)を用いたプロテオミクス。
我々は、MSを用いてCSFで検出された「疼痛タンパク質」が、典型的にはシナプス伝達、炎症反応、神経ペプチドシグナル伝達およびホルモン活性に関連していることを見出した。さらに、FMおよびRAにおける慢性疼痛に潜在的に関連する10個のタンパク質を見出した:神経細胞接着分子L1、補体C4-A、リゾチームC、受容体型チロシン – タンパク質ホスファターゼゼータ、アポリポタンパク質D、アルファ-1- 抗キモトリプシン、グラニュリン、カルシウム/カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼII型サブユニットα、肥満/幹細胞増殖因子受容体キット、増殖密度リポタンパク質受容体関連タンパク質 1。これらのタンパク質は、機能不全/炎症性慢性疼痛のメカニズムを理解するためにも、また潜在的なバイオマーカーとして使用するためにも重要である可能性があります。
意義
慢性疼痛は一般的な病気であり、それは世界的な健康に大きな負担をかけています。線維筋痛症(FM)は、慢性広範囲疼痛(CWP)を特徴とする未知の病因の不均一疾患である。FMの診断と治療は臨床評価の分析に基づいており、測定可能なバイオマーカーはありません。脳脊髄液(CSF)は、慢性疼痛を含む神経系の疾患のための豊富なバイオマーカーの供給源として歴史的に考えられてきた。ここでは、多変量データ解析と組み合わせた質量分析ベースの定量的プロテオミクス法を利用してFM患者のCSF プロテオームを探るCSFプロテオームのダイナミクスを監視するために。この探索的研究における我々の知見は、炎症反応、神経ペプチドシグナル伝達およびホルモン活性を含む特定のドメインで、CSFにおける疼痛関連タンパク質の顕著な存在を支持する。我々は大幅に変更されたタンパク質の分子機能を調査し、CSFにおける176の既知の疼痛関連タンパク質の存在を実証した。さらに、FMおよびRAの疼痛に潜在的に関連する10個のタンパク質を見出した:神経細胞接着分子L1、補体C4-A、リゾチームC、受容体型チロシン – タンパク質ホスファターゼゼータ、アポリポタンパク質D、アルファ-1-抗キモトリプシン、グラニュリン、カルシウム/カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼII型サブユニットα、肥満/幹細胞増殖因子受容体キット、増殖密度リポタンパク質受容体関連タンパク質1。シグナル伝達。これらの結果は、ヒトCSFおよびMSに基づくプロテオミクスを利用する疼痛の分野で働いている研究者および臨床医にとって明らかに重要かつ興味あるものであるはずである。
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キーワード
疼痛慢性の痛み線維筋痛症慢性関節リウマチ疼痛プロテオーム脳脊髄液
1 。前書き
慢性疼痛は今日の主要な医学的課題の1つを表しており、そして診断および薬物開発の観点の両方から、臨床前および臨床的に疾患の複雑さを解明することに多大な努力が注がれてきた。この限られた数の研究にもかかわらず、慢性疼痛に関連して質量分析法(MS)を用いて脳脊髄液(CSF)プロテオームを探索することが行われてきた。
タンパク質、小さなシグナル伝達分子、シグナル伝達ペプチド、代謝産物、および他の細胞産物を含む脳脊髄液は中枢神経系(CNS)と直接接触しており、CNSで起こる生化学的変化を反映すると考えられています。総合MSベースのプロテオミクス研究が特徴づけるために実施されたタンパク質含有量、通常2500-3000タンパク質の報告、CSFのを、[ 1、2 ]。これにもかかわらず、CSF中のこれらのタンパク質の存在は、急性および慢性疼痛のメカニズムおよびマーカーに関してこれまでに知られていることに関して限定的にしか特徴付けられていない。
線維筋痛症(FM)として知られる慢性疼痛疾患は、慢性広範囲疼痛(CWP)を特徴とする未知の病因の不均一状態である。この疾患の根本的なメカニズムは不明であり、診断に利用できるバイオマーカーはありません[ 3 ]。線維筋痛症は、米国リウマチ学会(ACR)1990基準に従って、広範囲の疼痛および圧痛に基づいて分類されている。また、主な臨床使用を意図し、新しい分類基準、広範囲の痛みを強調し、疲労、病気の重要な機能として、未リフレッシュ睡眠andcognitive症状[ 4、5]。線維筋痛症は、疼痛メカニズムの理解が不完全であるため治療が困難であり、診断目的および予後目的がないために治療反応の効果をモニターすることが困難である[ 6 ]。末梢疼痛メカニズムは小さな神経線維の病理を含め、FM中で報告されているが[ 7 ]に乱れ筋肉代謝 [ 8、9 ]、改変されたオピオイド関数[ 8 ]に関連付けられている遺伝因子 [ 10炎症性サイトカインの】可能寄与と免疫系[ 11、12 ]を示す神経炎症[ 13、14CNS 侵害受容処理の変更がFM病態生理学において非常に重要である可能性があることを示す広範な報告がある[ 8、[15]、[16]、[17]、[18]、[19 ]。現在、客観的な測定可能なバイオマーカーの欠如もあり[ 6 ]、診断および予後の目的、ならびに治療反応のモニタリングに使用することができます。
現在の研究の目的は、疼痛シグナル伝達において重要であると考えられている遺伝子に関して、どのタンパク質産物がヒトCSFにおいて見出されたかを調べることであった[ 20 ]。これらの知見に基づいて、機能不全疼痛(FM)と末梢関節の炎症の繰り返しを特徴とする慢性炎症性疼痛(RA)との間に起こりうる病理学的差異についても理解を深めることを望みました。疾患経過中の末梢性および中枢性の疼痛感作としてのもの[ 21 ]。これら2群の患者のCSFプロテオームを、定量的プロテオミクスと組み合わせてオフラインサンプル前分画を利用して、非疼痛、非炎症性対照由来のCSFと比較した。これらの患者群間の半定量的差異を決定するために、安定同位体標識に基づく。
2 。方法
2.1 。CSFプロテオームと痛みの遺伝子
どのタンパク質産物がヒトCSF中に見出されたかを調べるために、我々はGuldbrandsenらによって行われた2つの最も広範な研究を使用した。[2]およびSchutzer et al。[ 1 ]正常なCSFタンパク質をマッピングしました。Guldbrandsenらによって行われた研究。Schutzerらは、(それらのUniProt受入と共に)3081のユニークなタンパク質を報告した。もともとIPI識別子を持つ2630タンパク質を報告した。UniProtのタンパク質配列を用いて行われた我々の研究に匹敵するように、我々は Schutzerらによって報告されたタンパク質の変換されたバージョンを用いた。2134のユニークなタンパク質が含まれています。
CSF中の疼痛タンパク質の存在を調べるために、我々は元来Ultsch et al。により公表された疼痛関連遺伝子の包括的なリストを使用した。[ 20 ]、535遺伝子を含む。UniProtの「Retrieve / ID mapping」ツールを用いて遺伝子名をUniProtアクセッションに変換した。531個の遺伝子の数が、残りの分析で使用されたUniProt受入に確実に変換され得た。
2.2 。患者さん
現在の研究に関わっている13人のFM患者は、ストックホルムのDanderyds病院のリハビリテーション医学部の外来患者であり、FMのAmerican Rheumatology(ACR)1990の分類基準を満たしていた[ 22 ]。いかなる抗うつ薬は許されなかったと何の非ステロイド系抗炎症薬(NSAID)がCSFのサンプリングの前に24時間以内に投与しませんでした。FM患者のどれも他の神経疾患や既知の痛みを伴う症状を持っていませんでした。
このプロジェクトに参加した11人の慢性関節リウマチ(RA)患者は、ストックホルムのカロリンスカ大学病院のリウマチ科の外来患者であり、1987年および2010年のRAのACR基準を満たしていた[ 23 ]。これらの患者はFMのACR基準を満たさなかった。28関節数(DAS28)の平均疾患活動性スコア(±標準偏差)は3.8±1.3であった。すべての患者が陽性のリウマチ因子(RF)を有し、そしてシトルリン化タンパク質/ペプチド抗原(ACPA)に対する抗体を有した。5人の患者はメトトレキサート(MTX)で治療され、2人はプレドニゾロンと併用されたMTXであり、2人の患者はサラゾピリン単独療法であり、1人はプレドニゾロンと併用されたそして1人がオンであったアダリムマブ単独療法。どの患者も抗うつ薬を飲んでいませんでした。CSFサンプリングの24時間以内にNSAIDは投与されなかった。どのRA患者も神経疾患を患っていなかった。
非炎症性神経症状(他の神経疾患:OND)を有する8人の患者を対照として使用した。通常の血液検査、CSF分析および脳MR を用いても炎症性疾患の徴候は見られませんでした。OND対照の1つは片頭痛を報告したため、統計解析の対照として除外した。このグループのどの患者も慢性疼痛を患っていなかった。現在の研究に含まれる患者に関する他の情報は、表1および補足表S1に列挙されている。
表1。研究に参加した患者の特徴
患者グループ FM RA OND
患者数 13年 11 8
年齢、平均 47(25−60) 52(39−59) 53(45−60)
性別女性男性 13/02 11/02 8/0
VAS、痛み、平均 67 25年 N / D
VAS、疲労、平均 70 48 N / D
CSFサンプルは、患者からのインフォームドコンセントを得て収集された。この研究はカロリンスカ研究所の地域倫理委員会によって承認され、ヘルシンキ宣言に従って行われた。
2.3 。腰椎穿刺
脳脊髄液をポリプロピレンチューブ中にサンプリングし、直ちに遠心分離し、そして上清を凍結しそして使用するまで-80℃で貯蔵した。
2.4 。タンパク質消化
FMおよびRAのCSFサンプル(70μL)およびONDのCSF(100μL)の等分量を、内部標準(チキンオボアルブミン、Uniprot登録番号P01012)を含有する還元変性溶液12および17.4μLとそれぞれ混合した。この還元変性溶液は、33mMのTCEP(トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン; Sigma-Aldrich、St. Louis、US-MO)、0.67%ドデシル硫酸ナトリウムからなるものであった。(SDS; Sigma − Aldrich、セントルイス、US − MO)8.3ng / μLのオボアルブミンおよび167mMトリエチルアンモニウムバイカーボネート緩衝液、pH8.5(TEAB; Sigma − Aldrich、セントルイス、US − MO)、4.8の最終濃度を得る。 mM TCEP、0.1%SDS、1.2 ng /μLオボアルブミン、および24.4 mM TEAB。試料を500rpmで30分間振盪しながら65℃でインキュベートした。試料を室温に冷却し、300mM ヨードアセトアミド(IAA; Sigma-Aldrich、セントルイス、US-MO)を37℃、500rpmで1時間のアルキル化のために17mMの最終濃度まで試料に添加した。闇。最後に、最終濃度17mMの300mMジチオトレイトール(DTT; Sigma − Aldrich、米国ミズーリ州セントルイス)を添加し、サンプルを30分間混合した。最初のLys-C(1:50、酵素:基質)を添加することによって三段階酵素消化を行った。; Lys-C; PromegaCorporation、Madison、US - WI)および37℃でONにインキュベートし、続いてトリプシン消化(1:100、酵素:基質;トリプシン; ThermoFisher Scientific、米国カリフォルニア州サンノゼ)および37℃で3時間インキュベート。その後、さらにトリプシンを加え(1:100、酵素:基質)、37℃で一晩インキュベートした。
2.5 。安定同位体標識
得られたペプチド試料(試料当たり約15μgのCSFタンパク質に相当する)を、LC − MS / MSにより切断効率について無作為に試験した。そして、見逃した切断部位の数は、調査したすべての試料について<10%であった。続いて、製造業者の説明書に従って若干の変更を加えて、TMT10plex(商標)同重体標識試薬セット(ThermoFisher Scientific)を用いてすべての試料を標識した。簡単に説明すると、各サンプルについて50μLの消化物を等分し、22μLの8μg/μLのTMT試薬溶液(アセトニトリルに新たに溶解したもの)を室温で3時間インキュベートする前に加えた。3時間後、20μLの1M Tris − HCl(pH8)を添加し、室温で15分間インキュベートし、続いて個々の試料をプールしてプールしたTMT試料(「TMTセット」)を生成することによって各標識反応をクエンチした。4セットのTMT10plex™セットは、ONDサンプルのみの内部標準を含む各セットのFM、RAおよびONDサンプルを組み合わせて設計されました。過剰のTMT試薬24 ]および2)Strata-X 10 mgカートリッジ(Phenomenex)を用いた固相抽出(SPE)。SPEカラムから溶出した後、サンプルをspeed-vacで乾燥させ、さらなる実験の前に-20℃で保存した。
2.6 。サンプル分別
TMT標識ペプチド試料のオフライン試料分画は、Agilent 1100 HPLCシステムを用いて行った。試料を20mMのアンモニアに溶解し、 XBridge Peptide BEH 300、C18、2.1×250mm、3.5μmカラム(Waters Corp、Milford、MA)にロードした。ペプチドを流速200μL /分で分離した。溶媒Aは水中20mMのアンモニアを含み、溶媒Bは80%アセトニトリル中の20mMのアンモニアを含んでいた。ペプチドは、1)3%-42%B(40分)および2)42%-84%B(20分)の2段階グラジエントを使用して分離しました。各画分を1分間集めた。得られた画分をグラジエント領域にわたって最終8画分にプールし、speed-vacで乾燥させた。
2.7 。液体クロマトグラフィー – タンデム質量分析(LC - MS / MS)
分画したTMT標識ペプチドサンプルをローディングバッファー(0.1%FA)に溶解し、EASY − Spray(商標)源(Thermo Fisher Scientific)を介して四重極オービトラップ質量分析計(Q Exactive、Thermo Fisher)に結合したDionex UltiMate(商標)3000 RSLC Nanoシステムによって分析した。科学)。ペプチドをAcclaim PepMap100 C18、5μm、100Å、2 cmカラムに捕捉し、3〜37%の緩衝液B(0.1%FA、95%)の直線90分グラジエントを用いて50 cm EASY-Spray™C18 LC-カラムで分離した。 250nl /分の流速での%ACN)。MSスペクトルは、300〜1600 m / zの範囲でポジティブモードのデータ依存型取得(トップ5)で取得しました 。フルスキャンMSスペクトルの目標値(最大AGC値)は3×106に設定した。最大注入時間は250 ms、分解能は70,000です。前駆体イオンのフラグメンテーションは、34eVの衝突エネルギーでのより高いエネルギーのCトラップ解離によって行われた。合体を回避するために、最大注入時間500ms、最大AGC値1e5でMS / MSスキャンを記録しました[ 25 ] MS / MS分解能は35,000、スキャン範囲は200〜2000  m / z、分離ウィンドウは1.6  m / zおよび動的除外時間は60秒に設定されました。
2.8 。タンパク質同定と多変量データ解析
質量分析の生データファイルをProteome Discoverer 2.1 によって分析し、Se Swiss HT 検索エンジンを使用してヒトSwissProt タンパク質データベース(42,163の標準配列およびアイソフォーム配列を含む、2015-09-24)に対して ペプチドを同定した。酵素特異性を「トリプシン」に設定し、2つの切断された切断部位を許容した。25 ppmと50 mDaの質量許容差は、それぞれ前駆体イオンとフラグメントイオンの一致に対して設定されました。N-末端 アミンおよびリシルε-アミン基のカルバミドメチル化およびTMT修飾を固定修飾として設定した。
同定され定量されたタンパク質のリストは、Percolatorスコアリングによって決定されたPSMレベルでの1%FDR閾値に基づいて「高い」信頼度で同定されたタンパク質に絞り込まれた(q値)。データをlog 2スケールに変換し、limmaパッケージで実行した各MS内でnormalizeWithinArrays関数を使用して正規化しました[ 26]。このように、「M」は、各個別のサンプルが共通の参照によって差し引かれるように繰り返し選択され、「A」はその特定のMS分析におけるすべての標識の平均であった。生物学的サンプルにわたって<90%の欠損値を有するタンパク質を統計的試験のために選択した。3つのグループ(すなわちY変数)の分離に関与するタンパク質(すなわちX変数)を選択するために、多変量解析をPLS判別分析(PLS − DA)を用いて行った(Rのroplsパッケージ[27]に実装)。 5つの要素を使用し、1つ除外相互検証 モデルの予測性能はR2(Y 分散の割合)によって評価された。モデルによって説明される)およびQ2(交差検定によって計算されたモデルの予測能力)。R2およびQ2の有意性は、これらの値を、Y値のランダム置換によって生じる対応する測定値と比較することによって評価した。結果として得られるp 値は、置換によって得られるR2とQ2の比率がR2とQ2を超えることを示します。タンパク質の重要性は、クラス識別のための各タンパク質の相対的な重要性を示す、射影における可変的重要性(VIP)によって評価された。1.3より高いVIPを有するタンパク質を最も識別力のあるタンパク質として選択した。選択されたタンパク質について、Mann-Whitney U検定を使用して対ごとの事後比較を行った。p <0.05の結果を統計学的に有意と見なした。
2.9 。既知の疼痛遺伝子に関するCSFタンパク質の濃縮分析
さまざまなカテゴリーのタンパク質の生物学的機能を調べるために、DAVIDを使用して、遺伝子リストに変換された以下のタンパク質および背景に基づいて、生物学的機能および分子機能の過剰表示分析を行った[ 28 ]。遺伝子濃縮解析では、「タンパク質」という用語を使用します。遺伝子は複数のタンパク質種をもたらす可能性があるため、これは完全には正しくありませんが、タンパク質に基づいて利用可能な濃縮分析は現在ありません。以下の濃縮分析が行われました。
1。
本研究ならびにGuldbrandsen et al。[2]およびSchutzer et al。[ 1 ]をターゲットとし、ホモ・サピエンスゲノム全体を背景としています。
2。
標的としての痛み関連タンパク質(n = 531)および背景としての全ホモサピエンスゲノム。
3。
CSF中の全ての疼痛関連タンパク質(本研究、GuldbrandsenらおよびSchutzerらにより報告されたCSFタンパク質との疼痛タンパク質の重複を含む)および本研究ならびにGuldbrandsenらを含むCSF中の全ての同定されたタンパク質。Schutzer et al。背景として
4。
標的としてのCSF中の疼痛関連タンパク質およびバックグラウンドとしての全ての疼痛タンパク質(n = 531)。
誤発見率(FDR)が0.05未満の用語は強化されていると見なされました。
3 。結果
3.1 。CSF疼痛プロテオームの特徴
FM、RAおよびONDと診断された患者から由来する32のCSFサンプルの定性的(n = 32)および定量的(n = 31)プロテオミクス分析を行った。合計で1422個のタンパク質を同定しました(図1)。我々は、ここで同定されたタンパク質をGuldbrandsenらによって発見されたものと一緒に加えることによって、CSF中で典型的に検出されたタンパク質のリストをまとめた。(n = 3081)およびSchutzer et al。(n = 2135)、合計3787の独特のタンパク質が生じた(図2)。3つ全ての研究の間の重複は1083タンパク質であり、そして60タンパク質は本研究における新規の発見である。この「完全CSFプロテオーム」を完全ヒトプロテオームと比較した。。濃縮分析は、多数(n = 148)のGO用語が過剰に表されていることを明らかにした。数値的に最大のGO用語は、タンパク質結合、カルシウムイオン結合、タンパク質分解、細胞接着、受容体結合、補体系および炎症反応および免疫反応に関連している(補足表S2)。
Ultschらによって報告された翻訳された「疼痛タンパク質」の概要を得るために。(n = 531)、これらのタンパク質もまた完全なプロテオームと比較された。予想通り、多数のGO用語が強化されました(n = 163)。数値的に最大の用語は、典型的にはタンパク質結合、シグナル伝達、Gタンパク質共役型受容体シグナル伝達、炎症反応、疼痛の感覚的知覚および免疫系に関連していた(図3A、補足表S3)。
CSF中に見出された3787個のタンパク質のうち、176個が疼痛関連タンパク質と重複していた(図2、補足表S4)。タンパク質プロタキキニン-1およびオレキシンは現在の研究にとって新規であった。CSFプロテオームと比較して、10のGO用語が濃縮されていることがわかった。これらのGO用語のタンパク質部分は、典型的にはシナプス伝達、炎症反応、神経ペプチドシグナル伝達およびホルモン活性、ならびに血圧の調節に関与している(図3B、補足表S5)。これらのタンパク質が疼痛シグナル伝達における特定の部分に関与しているかどうかを調べるために、我々はまた176のCSFタンパク質の過剰発現を調べた。背景として疼痛関連タンパク質(n = 531)を使用する。FDR <0.05を用いて過剰に表される用語は見いだされなかったが、最も低いp値(0.005)を有する用語は神経ペプチドホルモン活性、タンパク質分解およびエンドペプチダーゼ活性であることが見出された(補足表S6)。これを支持して、結果は完全なゲノムと比較して強化され、ニューロペプチドホルモン活性およびシナプス伝達に関連するタンパク質の明らかな濃縮をもたらす(補足表S7)。
3.2 。FM、RAおよびONDのプロテオミクスCSF分析
同定された1422個のタンパク質のうち、855個のタンパク質が定量的データ分析に含まれ得る。表1に、本発明者らは、FM、RAおよび他の神経疾患(OND)を有する患者の試料を比較する多変量統計分析を適用した。PLS-DAを使用して、どのタンパク質がグループを区別するのに重要であるかを調べました。多変量解析は、3つの異なる基の存在が明らかになった(R2 = 0.96とQ2 = 0.44、R2のp個の -値= 0.05、Q2のp値= 0.05、図4 )。グループを区別するために、全部で96個のタンパク質が重要であることがわかった(VIP> 1.3)。これらのうちの10個は疼痛タンパク質であることがわかった。それらは降順であった:神経細胞接着分子L1(L1CAM)、補体C4-A(C4A)、リゾチームC(LYZ)、受容体型チロシン – プロテインホスファターゼゼータ(PTPRZ)、アポリポタンパク質D(ApoD)、アルファ -1- 抗キモトリプシン(セルピンA3)、グラニュリン(GRN) )、カルシウム/カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼII型サブユニットα(CaMKIIα)、肥満/幹細胞増殖因子受容体キット(c − Kit)、増殖密度リポタンパク質受容体関連タンパク質1(LRP1)(図5および補足表) S8)。
10個のタンパク質に対するマンホイットニー検定の結果を図5に示す。神経細胞接着分子L1のレベルは、RAと比較してFMにおいて統計的に有意に高かったが、ONDではなかった。FMおよびRAと比較して、統計学的に有意に高いレベルの補体C4-Aが存在した。アポリポタンパク質Dのレベルは、ONDと比較してFMおよびRAにおいて有意に低かった。アルファ-1-抗キモトリプシンは、RAと比較してFMにおいて統計的に有意に高いレベルを示したが、ONDとは比較しなかった。グラニュリンおよび肥満/幹細胞増殖因子受容体キットのレベルは、ONDと比較してFMにおいて有意に高かった。
図1
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図1。実験的なワークフロー FM、RAおよび対照OND群を有する患者からのCSFサンプルを腰椎穿刺により収集し、続いて等しいCSFアリコートを減少させ、アルキル化し、そしてトリプシンにより消化した。得られたペプチドをTMT-10プレックス試薬キットを用いて標識し、サンプル分画前に混合した。HPLC機器を用いたオフラインペプチド分離により、サンプルの複雑さの度合いが減少した。得られた80画分をグラジエント領域にわたって最終8画分に合わせた。最終8画分をLC − MS / MSによって分析した。取得データ中のタンパク質を同定し、定量し、そして取得データを最終的に多変量統計法を用いて分析した。
図2
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図2。本研究で同定されたタンパク質のGuldbrandsenらによって報告されたものとの重複。[2]およびSchutzer et al。[ 1 ] かっこ内:Ultsch et al。によって痛みに関連していると報告されているタンパク質の数。[ 20 ]。531の翻訳された疼痛タンパク質のうち、176がCSF中に見出された。
図3
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図3。生物学的機能と分子機能に基づくタンパク質の過剰表示分析 A:Ultschらによって報告された疼痛タンパク質。[ 20 ]対背景としてのホモサピエンスゲノム全体。合計163のGO用語が過剰に表現されていました。円グラフには、数値的に最大の15のGO用語が示されています。B:見出されたCSF中の全てのタンパク質と比較してCSF中に見出された疼痛関連タンパク質(n = 176)。
図4
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図4。FM、RAおよびONDの患者から得られたCSFタンパク質の PLS-DAを用いた多変量解析。グループ間の明確な分離は、最初の3つの要素を調べることによってわかりました。最初のコンポーネントは主にFMとRA / ONDを組み合わせた違いを表示します。3番目の要素は、主にRAとFM / ONDの組み合わせの差を表示します。A、B、C:データ変動性の第1および第2、第1および第3、第2および第3の成分がそれぞれ示されている。
図5
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図5。3群の多変量解析における10個のタンパク質のバンド数を分析した(FM:線維筋痛症、RA:慢性関節リウマチおよびOND:その他の神経疾患)。グループ間の存在量は、ペアマンホイットニー検定を使用して比較されます(0.0001-0.001: “***”、0.001-0.01: “**”、0.01-0.05: “*”)。
4 。討論
CSF中のタンパク質濃度は20〜40 mg / dLの範囲にあり、これは血清タンパク質濃度の約1%です[ 29 ]。CSFタンパク質の80%までが血漿に由来し、CNSに由来するのは20%にすぎない[30]。アルブミンおよびIgGはCSF中で最も豊富なタンパク質である(全CSFタンパク質の最大70%)。非常に豊富なタンパク質の存在は、他のCSFタンパク質、特に低豊富なタンパク質のMSに基づく分析を妨げる。豊富なタンパク質の除去、2Dゲル電気泳動によるタンパク質分離、タンパク質とペプチドの分画など、さまざまなサンプル調製方法メソッドの感度を高め、詳細なタンパク質分析を実行するために開発されました。
この研究では、CSFプロテオームの分析のためにHPLCを用いたペプチド予備分画と組み合わせて多重化技術を利用するMSベースの定量的プロテオミクスを使用した。これにより、1422個のタンパク質を同定することができました。健康なドナーからのCSFについて行われた最も包括的な研究のうちの2つは、それぞれ3081および2630タンパク質の同定を報告した。最初の研究[ 2 ]では、CSFタンパク質のSDS-PAGE 分離、免疫除去および混合モード逆相 – 陰イオン交換分画が徹底的なCSF プロテオーム解析に必要でした。2番目の研究[ 1 ] では、免疫親和性を含む広範なサンプル調製LC − MS / MS分析の前に枯渇およびSCX分画を実施した。両方の研究においてタンパク質定量化は行わなかった。
MSベースのプロテオミクスを使用してCSF中に見出されるタンパク質は、明らかにCNSシステムに特異的ではないが、それらは典型的にはタンパク質結合、タンパク質分解、免疫系および炎症などのより一般的な機構に関与している。疼痛の観点からすると、これは重要な所見です。なぜなら、「既知の」疼痛遺伝子の大部分は、これらのより一般的なプロセスに通常含まれる我々の濃縮分析によるものだからです。別の重要な観察は、我々の濃縮分析によれば、ニューロペプチドに関連するタンパク質の明らかな濃縮があるということである。CSFで検出および測定できるシグナリング。CSFの分析に使用する方法を選択する際には、これを考慮に入れる必要があります。一般に、疼痛シグナル伝達に重要なタンパク質はしばしばCSF中に低濃度で見られると考えられている。これは、Gulbrandsen et al。によって行われた徹底的な事前分別が行われたという観察によって強化されている。現在の研究(2/60)およびSchutzerらによって行われた研究と比較して、検出された「疼痛タンパク質」(47/1334)の比例的な増加をもたらした。(10/625)これは、MS分析の前に、発見および比較的定量化することができる疼痛タンパク質の数を増加させるための多重化と組み合わせた、さまざまな前分画戦略の必要性を強調している。
4.1 。FM、RAおよび非疼痛管理のプロテオミクスCSF分析
Guldbrandsenらとは対照的に。[2]およびSchutzer et al。[ 1 ]、我々は定量的タンパク質研究も行った。FM、RA、およびONDに罹患している患者に由来する、合計で855のタンパク質が31のCSFサンプルすべてにわたって相対的に定量された。これら61のうち、痛みが知られているタンパク質があります。
炎症反応、シグナル伝達、細胞増殖、細胞タンパク質代謝過程、軸索誘導および軸索損傷に対する反応に通常関与する多変量解析において10個の「疼痛タンパク質」を見出した。
我々の結果では、神経細胞接着分子L1(L1CAM)が最も高い識別力(VIP = 1.9)を示した。L1CAMは、神経系の発達、ニューロンの遊走および生存において重要な役割を果たす細胞接着分子である。L1CAMは、発生中および再生中の軸索に発現しており、軸索成長を促進する。侵害受容のDRG内タンパク質分解を減少したが経路、全長L1CAMは、後角に蓄積されている[ 31 ]。動物実験では、末梢神経損傷は、DRGおよび疼痛様行動の変化と共に、後角のシナプス前シナプスにおける L1CAMの増加をもたらす。抗L1CAM抗体の使用は用量依存的に機械的および抗生物質の両方で有意に抑制された熱痛覚過敏 [ 31]。図5Aにおいて、RA患者群のCSF試料中のL1CAMのレベルは、FM群および対照群の両方と比較して低いことがわかる。最近、RAの治療に実際に使用されている非ステロイド系抗炎症薬(NSAD)の 1つであるセレコキシブが、膵臓癌において濃度依存的にL1CAMの発現を阻害することが示された[32]。RA患者におけるより低いレベルのL1CAMは、この群の患者において我々がRA治療の効果を見るかもしれないことを示唆する。
製品補体系は、アナフィラトキシン C3aおよびC5aは、神経因性疼痛[直接関与してい33 ]。補体4のアイソタイプの1つである酸性補体C4、C4Aは、IgGまたは免疫複合体抗原へのアミド結合を形成するための有効な結合に関与している。神経因性疼痛の機序におけるC4Aの役割は依然として不明である。しかしながら、C4Aはプロテアーゼ活性化受容体 1および4(それぞれPAR1およびPAR4)の特異的リガンドであることが示され[ 34 ]、PAR4は内臓痛、炎症性疼痛および神経障害性疼痛のシグナル伝達経路において重要な機能を有する[ 35 ]。 。Aヒトにおけるシガトキシンの影響を対象とした症例/対照研究では、毒素に曝露された患者の89%がC4Aの正常値の4倍とC3Aの正常値を示していた[ 36 ]。シガトキシンにさらされると、疲労感、脱力感および末梢性疼痛を含む胃腸症候群および神経学的症候群が発症する。慢性疲労症候群の患者では、運動負荷は古典的な補体系経路を活性化し、C4Aレベルの上昇をもたらし、C4Aが慢性疲労症候群の潜在的マーカーとして示唆された[ 37 ]。興味深いことに、我々の結果(図5)B)は、RA患者ではなく、FM患者においてのみC4Aの上昇を示した。したがって、それは、FMの疼痛に関連する重度の疲労の特徴に関係している可能性がある。
リゾチームは、いくつかの細菌種に対する抗菌剤として機能します。リゾチームは炎症反応中の細胞間シグナル伝達にも関与している可能性があります[38]。CSFにおいて、リゾチームのレベルは、明らかな、可能性のある、または可能性のある炎症性CNS反応を有する患者において測定され、そして健康な患者と比較された。試験した患者のすべてのグループでリゾチームレベルの上昇が見られました[39]。リゾチームは慢性炎症を起こしている消化管の多くの器官でも上方制御されています[40]。IBSおよび慢性ストレスを有する患者の血漿細胞外小胞中のリゾチームの存在が示された[38]。]。さらに、リゾチームの存在は上皮細胞の遊走にとって重要であり、炎症および免疫シグナル伝達に関連するタンパク質の発現はリゾチーム処理によって変化した[ 38 ]。本研究で提示されたFMおよびRA患者のCSF中の上昇したレベルのリゾチームは、それらの疾患に関連する炎症過程を反映しているかもしれない(図 5C)。
受容体型チロシンタンパク質ホスファターゼゼータ(PTPRZ)はCNSで発現され、CNS発生、軸索形成に関与し、発生中の細胞接着およびシグナル伝達過程を媒介する。このタンパク質は発生および再生における軸索成長に影響を及ぼし、そして提示の様式に依存して抑制的または刺激的効果を証明する[41]。PTPRZはCNS損傷後に反応性星状細胞によって発現され、それによってグリア瘢痕の一因となる[42]。マウスでPTPRZをノックアウトすると、基準点でも炎症条件下でも中等度の熱刺激および触覚刺激に対する反応が低下することが示されている[ 43]。]。現在の研究では、決定されたPTPRZのレベルは、他の2つの群よりもFMの方が高く(図5D)、これは、FMにおける疼痛過敏症のメカニズムにおけるタンパク質の関与の可能性を示唆する。RA患者における低レベルのPTPRZは、それらの患者が受ける治療の効果によって説明される可能性がある。
アポリポタンパク質Dは、29-kDaのが分泌される糖タンパク質に属するリポカリンスーパーファミリー広く末梢神経およびCSFを含む様々な組織で発現される[ 44、 45 ]。中枢神経系では、ApoDはアストロサイトや希突起膠細胞から分泌され、アポリポタンパク質A-IVとともに再生末梢神経に蓄積します [ 46 ]。さらに、ApoD-KOマウスで行われた研究では、酸化的損傷の兆候、神経変性の初期の証拠、および反応性神経膠症および酸化ストレスに対する反応に対するApoDの重要性が示された [ 47 ]。神経因性疼痛モデルでは、上方制御後根神経節におけるApoDの発現は、損傷したDRGニューロンにおける軸索再生および可能なシグナル伝達への関与を示唆していることが実証された[ 48 ]。最近、痛みのない椎間板変性を有する患者のCSFサンプルにおいて、MSベースのプロテオミクスによって、無痛患者と比較しながら、有意に増加したレベルのアポリポタンパク質A〜IV、DおよびEが検出された[49]。また、ApoDは人体の組織や体液中で広く発現され、小さな代謝産物からより大きな脂肪酸分子までの広範囲の可能な結合リガンドを持っているので、タンパク質は環境や組織の種類に依存する局所機能を持つかもしれません。例えば、ApoDはの輸送に関与している可能性があります。アラキドン酸 [ 50 ]は、脳、肝臓、筋肉に豊富に含まれており、エイコサノイド、カルシウム流入に関与するシグナル伝達分子、細胞増殖、ホルモン調節、発熱、炎症、疼痛の前駆体です。図5に見られるように、FM患者におけるApoDレベルは下方制御され(図5E)、これはCSN恒常性における障害および修復機構における遅延を示唆している。
アルファ−1−抗キモトリプシン(セルピンA3)は急性期血清糖タンパク質であり、そして血漿プロテアーゼインヒビターとして働くセリンプロテアーゼインヒビタークラスのメンバーである。それは主に肝臓だけでなく脳を含む他の多くの臓器にも発現していた。セルピンA3の上昇したレベルは、AD患者の血清およびCSFにおいて報告された[51]。Vucuña等。DRGにおけるセルピンA3の発現増加、ならびに末梢感覚ニューロンにおけるセルピンA3の発現および誘導もまた、疼痛過敏症における急性から慢性への切り替えの調節におけるタンパク質の直接的関与を示唆している[52]。]。同じ研究において、著者らは、SerpinA3Nがマウスモデルにおいて神経因性疼痛を害することを報告し、そしてSerpinA3Nを欠くマウスが野生型マウスよりも神経因性異痛を発症することを実証した。この所見は、FM患者にびまん性痛覚過敏および/または異痛があるという事実と相関しています。これらのデータと一致して、本発明者らの結果は、他の研究された群と比較しながら、FM患者のCSF中のセルピンA3のレベルの減少を示す(図 5F)。
我々は、ONDと比較してFMおよびRAの両方において増加したレベルのグラニュリンを見出した(図 5G)。グラニュリンは、細胞増殖を調節し、抗炎症作用を有し、そして組織リモデリングに関与している分泌タンパク質のファミリーです。グラニュリンは、プログラニュリン(PRGN)を含む9つの鎖に切断されます。神経活動はPRGNの分泌を誘導します[ 53 ]。これは神経栄養因子として働き、神経突起伸長を促進します。神経因性疼痛防御におけるPGRNの役割は、予備神経損傷モデルにおいて実証されている。ラットで行われたこの研究は、神経損傷後の脊髄および後根神経節におけるPRGNの上方制御を示し、上方制御されたPRGNの主な原因は損傷を受けた神経細胞ミクログリアであった。神経損傷後のPGRN − KOマウスにおける機械的、熱的および低温的刺激に対する侵害受容感受性は、対照動物におけるよりも強かった。さらに、PGRN-KOマウスは神経損傷後にのみ50%まで回復しました[ 53 ]。プログラヌリンの欠失は、CSNの損傷、炎症誘発性サイトカイン(TNF-α、IL-1βおよびIL-6)の誘発、抗炎症性IL-10の産生低下、および活性化ミクログリアの炎症反応の促進に応答してニューロン喪失を引き起こす[ 54 ]。さらに、プログラニュリンの過剰発現は神経炎症を減少させ、軸索再生および感覚機能の回復に正の効果を示した[ 55 ]。総合すると、PRGNレベルの上昇は神経保護に関連している可能性があります。我々のデータに反映されているメカニズムとプログラニュリンの増加は、抗炎症メカニズムに向けられたメカニズムの活性化、傷害を受けたニューロンの生存の促進、および疼痛調節の役割がこの文脈ではあまりないように思われる。
カルシウム/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼII型サブユニットアルファ(CaMKIIα)、カムキナーゼIIの主要なアイソフォームで異なる役割を持つカルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼである可塑性でグルタミン酸作動性シナプス。げっ歯類では、CaMKIIαは、脊髄後角および後根神経節の表層を含む明瞭な疼痛処理脳領域において、モルヒネの鎮痛作用を媒介するμ-オピオイド受容体と共発現し共存している。 56]。マウスにおける有害な炎症刺激は、脊髄後角ニューロンの感作ならびにCaMKIIαmRNAおよびタンパク質発現の変化によって引き起こされる異痛症を誘発した。57 ]。また、ラットの後肢の足底切開は、CaMKIIαの脊髄を増加させました。これはリン酸化によって活性化され、2°の痛覚過敏を引き起こしました[ 57 ]。長期糖尿病動物モデルでは、後角におけるCaMKIIαの発現増加が神経障害症状の発症に影響を及ぼした[ 58 ]。FM群におけるCaMKIIαレベルの変化(図5H)は、侵害受容性疼痛メカニズムにおけるCaMKIIαの可能な役割を示唆している。
肥満細胞/幹細胞増殖因子受容体キットまたは受容体チロシンキナーゼc-Kit(c-Kit)は、必須細胞の開発、その機能および遊走における重要な役割を果たしています。それは細胞増殖および細胞生存の調節に関与し、そしてまたそのリガンド幹細胞因子(SCF)と共に、末梢疼痛および機械的増感において本質的な役割を有する[59]。C-Kit 侵害受容器機能を動物モデルで調べたところ、c-Kit受容体を欠くマウスは有害熱に対する感受性の低下と侵害受容性C線維の熱感受性の低下の両方を示したことが示された[ 59]。]。Sun et al。c-Kitは後角の層IおよびII層に発現し、層IIの内層にあるc-Kitは脊髄の内因性発現に由来し、c-Kit 変異マウスの行動反応を研究することによって得られるという証拠を提供持続性疼痛の発症に対するc-Kitの重要性を示唆した。ヒトの疼痛知覚におけるc-Kitの役割は、治療を受けた被験者において通常の温熱感と触感を変化させることなく、より低い温熱感と冷感の疼痛感受性を示す強力なチロシンキナーゼ阻害剤の投与を通して調べられた [ 60 ]。我々の結果(図5I)は、機能不全および炎症性疼痛状態の両方について疼痛感受性および持続性疼痛におけるその役割を提案している対照群と比較して、FM群およびRA群の両方において増大したレベルのc − Kitを示した。
成長密度リポタンパク質受容体関連タンパク質 1または低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質1、LRP-1、またはアポリポタンパク質Jを含むアポリポタンパク質E 含有リポタンパク質は、脳内で最も豊富なアポリポタンパク質です。星状細胞によって合成され、それらは体重、エネルギーバランスおよび神経行動機能 の調節に関与しています。LRP-1は細胞内への取り込みとプロテイナーゼの分解を仲介し、アルツハイマー病患者に見られるアミロイド斑の主成分である分泌型β-アミロイド前駆体タンパク質に結合し、その分解を仲介します[ 61 ]。LRP-1は量を調節しますアポリポタンパク質E 、カルシウムシグナル伝達、脳内の神経突起の成長および神経生存[ 62 ]。他のアポリポタンパク質と一緒になって、アポトーシスやストレスから神経細胞を保護することができます。また、傷害を受けたシュワン細胞と細胞生存のためのLRP-1の発現との間の相関関係が実証され、末梢神経傷害後のシュワン細胞生存のための重要なタンパク質としてLRP-1が示唆された[ 63 ]。FM群およびRA群において検出されたLRP - 1のレベルの低下(図5J)は、損傷を受けたニューロンの不適切な回復を示している可能性がある。
この研究の強みには、機能不全疼痛(FM)、炎症性疼痛状態(RA)、および非疼痛、非炎症性対照の患者からのCSFの独自のマッピングが含まれます。潜在的な制限は患者数が少ないことであり、現在のマッピングは主に探索的なものと考えられるべきであり、したがって結果はさらなる検証を必要としている。疼痛軽減薬からの介在効果を排除するために、鎮痛薬またはNSAIDは評価前24時間以内に許可されなかった。かどうかは知られていない免疫抑制剤は、CSFのプロテオームに影響を与える可能性がありますが、RA群ではそのような影響を最小限にするために、我々はで治療を受けた患者除外することにした高用量のプレドニゾロン 10mg /日以上を。
要約すると、我々は機能不全性疼痛、炎症性疼痛および対照を有する患者から得られたCSFにおけるプロテオームプロファイルの違いを調べるために、広範囲のバイオインフォマティクスデータ分析と組み合わせた定量的プロテオミクス法を用いた。我々は、CSFにおける176の既知の疼痛関連タンパク質の発現の証拠を見出した。濃縮分析は、これらのタンパク質の大部分が典型的にはシナプス伝達、炎症反応、神経ペプチドシグナル伝達およびホルモン活性、タンパク質分解、エンドペプチダーゼに関与していることを示している 活動と血圧の調節。さらに、多変量解析は、これらの疼痛状態においてCSFプロテオームを区別するための10個の疼痛タンパク質の重要性を同定した。機能不全/炎症性疼痛のメカニズムにおけるこれらのタンパク質の関与、ならびに潜在的なバイオマーカーとしての同定されたタンパク質の使用は、さらに調査されるべきである。
以下は、この記事に関連する補足データです。
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補足表S1。患者の人口統計学および臨床情報。
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補足表S2。本研究によりCSFにおいて同定された3787タンパク質の過剰表示分析、Guldbrandsen et al。Schutzer et al。背景としてゲノム全体に対する
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補足表S3。背景として疼痛対全ゲノムに関連する531個のタンパク質の過剰表示分析
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補足表S4。CSFで同定されたタンパク質と重複する176の疼痛関連タンパク質のリスト
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補足表S5。背景としてCSFタンパク質対CSFタンパク質(本研究、GuldbrandsenらおよびSchutzerら)において同定された、疼痛に関連する176個のタンパク質の過剰表示分析
スプレッドシートをダウンロードする(11KB)xlsxファイルに関するヘルプ
補足表S6。バックグラウンドとして疼痛関連タンパク質(n = 531)に対してCSFで同定された疼痛に関連する176タンパク質の過剰表示分析
スプレッドシートをダウンロードする(12KB)xlsxファイルに関するヘルプ
補足表S7。背景として全ゲノムに対してCSFで同定された疼痛に関連する176のタンパク質の過剰表示分析
スプレッドシートをダウンロードする(10KB)xlsxファイルに関するヘルプ
補足表S8。タンパク質は多変量統計解析を選択した。これは、疼痛タンパク質と重複する選択10をもたらした。p -値はマンホイットニー基づいているUのテスト。FM:線維筋痛症、RA:慢性関節リウマチ、OND:その他の神経疾患
謝辞
これらの結果につながる研究から資金提供を受けた、欧州連合(EU)セブンス枠組み計画(FP7 / 2007年から2013年)助成金の契約に基づく一切602919ません(GLORIA)、スウェーデンの医学研究評議会(2013から9306)、AKE Wiberg財団とマグナスBergvalls財団とスウェーデンのイノベーションシステム政府機関からの資金提供を受けた、ウプサラベルゼリ神経診断技術センター。資金提供者は、研究デザイン、データの収集と分析、公表の決定、または原稿の作成には何の役割もありませんでした。
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これらの著者はこの研究に等しく貢献した。
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研究への平等な貢献
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https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1874391918302240