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ハイライト

足首の関節周囲の炎症は、マウスにおいて握力の不足を誘発する。

この測定は、触覚異痛よりも既知の鎮痛薬に対してより敏感です。

触覚異痛症は、握力障害とは異なり、TRPV1発現ニューロンが関与しています。

握力障害と触覚異痛は完全に同等な尺度ではありません。

握力評価は新しい鎮痛薬の前臨床評価を改善するかもしれない
抽象
握力不足は、リウマチ性疾患における疼痛誘発性機能障害の尺度です。このパラメーターと触覚性異痛症(前臨床試験における標準的な疼痛測定値)が鎮痛薬および基本的機序に対するそれらの反応に類似性を示すかどうかを試験した。足首に完全フロイントアジュバント(CFA)を関節周囲注射したマウスは、関節周囲の免疫浸潤および滑膜の変化を、顕著な握力の欠如およびフォンフレイ毛を用いて測定された触覚異痛と共に示した。しかし、炎症誘発触覚異痛症は握力の変化よりも長く続いたため、機能障害を引き起こしませんでした。の経口投与オピオイド薬のオキシコドン(1〜8 mg / kg)およびトラマドール(10〜80 mg / kg)は、アセトアミノフェン(40〜320 mg / kg)または非ステロイド系抗炎症薬イブプロフェン(10〜80 mg / kg)よりも優れた握力回復を示しました。kg)またはセレコキシブ(40〜160 mg / kg)。これらの結果は、ヒトにおけるそれらの鎮痛効果と一致しています。握力不足を軽減する薬物用量はフォンフレイ閾値に対してほとんどまたは全く効果を示さなかったので、機能障害は一般に触覚性異痛よりも薬物誘発鎮痛のより敏感な指標であった。最後に、ルテニウムレッド(非選択的TRP拮抗薬)または in vivoレジリフェラトキシンを用いたTRPV1発現ニューロンの除去は、握力の欠如を変えることなく触覚の異痛を廃止した。このことは、触覚の異痛と握力の欠陥の神経生物学が異なることを示している。結論として、握力の不足は人間の痛みの経験の重要な側面を反映する痛みの明確なタイプによるものであり、それゆえベンチからベッドサイドへの新しい鎮痛薬の翻訳を改善するための前臨床試験におけるさらなる探求に値する。
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キーワード
握力機能障害動物モデル関節痛関節周囲の炎症鎮痛
略語
分散分析分散分析CFA完全フロイントアジュバントCOX-2シクロオキシゲナーゼ-2DRG後根神経節HPMCヒドロキシプロピルメチルセルロースNSAID非ステロイド性抗炎症薬ポー口頭でQST定量的官能検査RRルテニウムレッドRTXレジシフェラトキシンsc皮下SC脊髄TRP一過性受容体電位TRPV1一過性受容体電位バニロイド1
1 。前書き
疼痛は重要な世界的な健康問題であり、そして新しい鎮痛薬の必要性がある(Goldberg and McGee、2011)。しかし、ここ数十年の痛みのメカニズムの理解が大きく進歩したにもかかわらず、新しい鎮痛薬のベンチからベッドサイドへの翻訳はほとんど行われていません(Barrett、2015、Kissin、2010、Mao、2009)。
疼痛の動物モデルの予測的妥当性は激しく議論されており、疼痛研究の限定的翻訳の1つの考えられる理由は、実験動物およびヒト患者における疼痛および鎮痛の評価に用いられる転帰測定の違いである(Cobos and Portillo-Salido、2013)。、Mogil and Crager、2004、Negusら、2006、Negus、2013、Percie and Rice、2014)。理想的には、翻訳の目的のためには、動物実験は可能な限り日常の臨床診療および臨床試験をまねるべきです。前臨床慢性疼痛研究で使用される標準的な結果測定は、定量的官能検査から適応されています慢性疼痛を有する患者の評価のために設計された(QST)、そしてフォンフレイフィラメントは前臨床研究において機械的疼痛閾値を決定するために最も広く使用されているQST機器の1つである。ヒト患者では、QST法が神経因性疼痛中の感覚変化を検出するために使用されている(例えば Bennett、2001年、 Bouhassiraら、2005年、 Moharicら、2012年)。しかし、リウマチ性疾患のある患者にQSTを使用することはまれです。我々の知る限りでは、3つの公表された研究のみが関節リウマチのヒト患者においてフォンフレイフィラメントを使用した(Hendianiら、2003年、 Morrisら、1997年、 van Laarhovenら、2013年)。)、関節の炎症に伴って起こる最も厄介な痛みを伴う状態の一つ(Lee、2013、Scott et al。、2000 )。フォンフレイ試験によるこの少数の臨床報告は、関節痛の動物モデルにおいてこの技術を使用した数百の前臨床試験とは著しく対照的である。
痛みは複雑な現象です。ヒトの疼痛表現型の中核の一部には、有痛性疾患を有する患者における日常生活のいくつかの側面に悪影響を与える身体機能の変化が含まれる(Romera et al。、2011、Turner et al。、2005)。疼痛と身体機能との間の重要な関係のために、1セットのコンセンサスに基づく推奨は疼痛治療の臨床試験における主要な結果の1つとして身体機能の測定を支持している(Dworkin et al。、2008 )。これに関連して、握力は、関節炎を有する患者における機能的尺度としてリウマチ学において数十年間広く広く日常的に評価されてきた(例えば、Bijlsmaら、1987年、Lee、2013年、Pincus and Callahan、1992年)、そして驚くべきことに、それは疼痛と相関することが知られている(Callahanら、1987年、Fraserら、1999年、Overendら、1999年)。リウマチ学における握力の広範な使用にもかかわらず、この結果は実験動物における痛みの尺度としてはあまり特徴付けられていない。しかし、上記のように、触覚性異痛症の前臨床試験は豊富です。一過性受容体電位(TRP)チャネルまたはTRP発現侵害受容器が炎症性皮膚過敏症に関与することが知られている( Szallasi et al。、2007)。しかし、痛みによって誘発された機能障害をもたらす神経生物学的メカニズムについては、あまり知られていません。
これらの先例を踏まえて、本発明者らは、関節炎症対炎症性触覚異痛症を有するマウスにおける握力の感受性を異なる薬理学的クラスのいくつかの鎮痛薬の効果と比較することを目的とした。同じメカニズムから。
2 。材料と方法
2.1 。実験動物
実験開始時に体重28〜30 gの雌CD1マウス680匹(Charles River、バルセロナ、スペイン)で実験を行った。女性は男性よりも疼痛関連障害のリスクが高いと報告されているため、我々は雌性動物を選択している(例えば、Unruh、1996、Stubbs et al。、2010)。しかし、以前の研究では、雌性動物における疼痛誘発性機能障害の尺度として握力を評価していない。動物を発情周期を通して無作為に試験した。実験前は食餌と水を自由に摂取できるコロニーケージに収容し、温度と光を制御した部屋(22±2℃、12時間の明暗周期)で保管した。実験は明期(午前9時から午後3時まで)に行われた。すべての実験プロトコルは国際基準(欧州共同体評議会指令2010/63)に従って実施され、グラナダ大学の研究倫理委員会によって承認された。この研究における動物の数を減らすために、可能であれば、行動研究、組織学的分析および免疫染色に同じマウスを用いた。
2.2 。CFA誘発関節周囲炎
マウスに、完全なフロイントアジュバント(CFA)(Sigma-Aldrich、マドリード、スペイン)または無菌の生理食塩水(0.9%NaCl)を脛骨足関節周囲の対照として関節周囲注射した。均質な炎症を得るために、CFA(または食塩水)を10または15μL /注射(20または30μL /足)の容量で関節の内側および外側に2回の別々の注射で皮下投与した(Chenら、。 2009、Lolignier et al。、2011 )。私たちは、下30½ゲージの針で1710 TLLハミルトンマイクロシリンジ(Teknokroma、バルセロナ、スペイン)を使用し、イソフルラン麻酔(IsoVet ®、B.Braun、バルセロナ、スペイン)。CFA処置マウスは、投与部位およびその近傍領域(踵)に限定されるように見える顕著な炎症を有したが、足蹠は罹患しているようには思われなかった。これにより、これら2つの異なる領域で機械的しきい値をテストすることができました。詳細は「結果」を参照してください。体重減少または体重増加遅延は進行中の苦痛の兆候と見なされるため(Blackburn-Munro、2004)、体重を毎日モニターして、本プロトコルが動物に過度の害を引き起こさないことを確認した。炎症性浮腫は、電子ノギスを用いて足首の太さを測定することによってモニターした(例えば、Croci and Zarini、2007)。
2.3 。薬と薬の投与
我々は、次のプロトタイプ使用鎮痛薬、非ステロイド性抗炎症薬(NSAID):イブプロフェンナトリウム塩(10-80ミリグラム/ kg)を、シクロオキシゲナーゼ-2 (COX-2)阻害剤セレコキシブ(40~160ミリグラム/キログラム)、及びアセトアミノフェン(40 –320 mg / kg)(すべてSigma-Aldrich製)、オピオイドのトラマドール(10–80 mg / kg)および塩酸オキシコドン(1–8 mg / kg)(スペイン、バルセロナのLaboratorios Esteveから供給)。鎮痙性 バクロフェン(5〜20 mg / kg)(Sigma-Aldrich)の効果も試験しました。全ての薬物を0.5%ヒドロキシプロピルメチルセルロースに溶解した。1%Tween 80を補ったHPMC(両方ともSigma − Aldrich製)中に懸濁したセレコキシブおよびアセトアミノフェンを除いて(HPMC)。これらの薬物またはそれらの溶媒を10mL / kgの容量で経口(p.o.)投与した。
さらに、非選択的TRP拮抗薬であるルテニウムレッド(1〜2 mg / kg)(Sigma-Aldrich)の効果も試験しました(St Pierre et al。、2009)。ルテニウムレッドを食塩水に溶解し、5mL / kgの容量で肩甲骨間領域に皮下(s.c.)投与した。対照群には等量の生理食塩水を投与した。
全ての場合において、薬物投与後の行動評価は、治療を知らされていない観察者によって記録された。
2.4 。TRPバニロイド1(TRPV1)発現侵害受容ニューロンのin vivoアブレーション
TRPV1発現ニューロンを選択的に除去するためにレジニフェラトキシン(RTX)を使用した。薬物(Tocris Cookson Ltd、Bristol、UK)を通常の食塩水中の10%Tween 80および10%エタノールに溶解した。動物は、全ての末梢TRPV1 +ニューロンを切除することが以前に報告されている(Hsiehら、2012)、腹腔内注射によってRTX(50μg / kg)の単回投与を受けた。対照群には同量のビヒクルを投与した。行動試験または試料採取の5日前に、すべての処置をイソフルラン麻酔下で行い、苦痛を最小限にした。
2.5 。グリップ力の測定
握力は、コンピュータ化された握力計(Model 47200、Ugo - Basile、Varese、イタリア)を用いて測定した。装置は、力変換器に接続されたT字形の金属棒からなっていた。マウスの後肢の握力を測定するために、実験者はマウスを尾の付け根で穏やかに保持し、動物がその後肢で金属棒をつかむことができるようにした。記録中にマウスがその前足で金属棒を握るのを防ぐために、動物は最初に彼らの前足で金網シリンダーを掴むことを許された。マウスが後足でトランスデューサーの金属棒を握ったらすぐに、実験者は握り方がなくなるまで動物を尾で後ろに引っ張った。(後肢握力の測定に使用される手順を示す補足ビデオを参照してください)。各測定のピーク力は、装置によって自動的にグラム(g)で記録された。各マウスの後肢握力を三重に測定した。CFAまたは生理食塩水の投与前の異なる日における2回の測定の平均として、各動物について基礎握力値を記録した。この値を100%の握力とみなし、その後の測定の基準として使用した。
以下は、この記事に関連する補足データです。
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ビデオ。2
2.6 。フォンフレイしきい値の測定
点状刺激に対する機械的異痛症は、以前に記載された方法をわずかに修正して決定した(Chaplan et al。、1994 )。簡単に説明すると、動物は、後足の足底表面へのアクセスを提供するために、隆起したメッシュ底プラットフォーム上に配置されたメタクリレート試験区画(幅7.5cm×長さ7.5cm×高さ15cm)に2時間順応させた。足底刺激は、関節の炎症を持つ動物におけるフォンフレイフィラメントの標準的な適用部位である(例えば、Nietoら、2015年、Mangioneら、2016年)。)0.02〜1.4gの範囲の曲げ力を有する対数級数の較正済みフォンフレイモノフィラメント(Stoelting、Wood Dale、IL、USA)を、0.6gのフィラメントから始めて上下のパラダイムを用いて適用した。機械的刺激に対する感作を避けるために、フィラメントを2〜3秒間で2回塗布し、塗布間の間隔は少なくとも30秒間とした。フィラメントへの反応は、刺激された足の即時のなめる/噛む、しゃがむ、または急速な引っ込みが観察された場合、陽性と見なした。握力の決定に関しては、CFAまたは食塩水の投与前の異なる日の2回の決定の平均として各動物について基礎値を記録した。この値は、フォンフレイ閾値の100%と考えられ、その後の決定のための基準として使用された。
2.7 。自発運動量の測定
歩行運動は、先に記載した方法に従って、48の赤外線フォトセルのエミッタおよび検出器を備えた赤外線検出器(メッド関連社、セント・オールバンズ、VT、USA)を用いて測定した(サンチェス-フェルナンデスら、2013 )わずかな変更を加えて。簡単に説明すると、動物を透明な評価室(幅27.5cm×長さ27.5cm×高さ20cm)に個別に入れ、30分間の移動距離(水平方向の活動)および立ち上がり回数(垂直方向の活動)を記録した。評価室への慣れを避けるために動物を一度だけ試験したが、これはそれらの自発運動量を著しく減少させた。。すべての実験は、薄暗い照明(7-10ルクス; Luxometer SM700、Milkwaukee 4 Electronics Kft。、Szeged、ハンガリー)のある防音室で行われました。評価期間中、実験室に実験者はいなかった。
2.8 。組織学
マウスをイソフルラン(IsoVet(登録商標)、B.Braun、スペイン、バルセロナ)で麻酔し、20mLの生理食塩水、続いて4%ホルムアルデヒド溶液で心臓内灌流した。灌流後、足を解剖し、室温で48時間、10%緩衝ホルマリンで固定した。次に関節をアンモールス溶液(50mLのギ酸および50mLの20%クエン酸ナトリウム)中で室温で14日間脱灰した。次に、それらを縦に切断し、アルコールで脱水し、そしてパラフィンに包埋した。本発明者らは、足パッドサンプルを染色するために同様のプロトコルを使用したが、3mmのパンチで組織を得、そして脱灰工程を省略した。組織切片(7〜10μm)をヘマトキシリンとエオシンで染色した。DS-Ri 11カメラを備えたNikon Eclipse 50i顕微鏡を用いて画像を取得した。
2.9 。免疫組織化学
マウスを上記のように経心的に灌流し、そしてL4後根神経節および脊髄腰椎拡大を解剖し、後固定し、脱水し、そして標準的な手順を用いてパラフィン中に包埋した。組織切片(5μm)をキシロール(Panreac Quimica、Castellar del Vales、スペイン)中で脱パラフィンし、そして再水和した。抗原は、1%クエン酸緩衝液を用いて蒸気加熱することによって回収した。切片をブロッキング溶液(トリス緩衝液中5%正常ロバ血清、0.3%トリトンX − 100、0.1%ツイーン20)中で1時間インキュベートした。溶液)。その後、スライスをブロッキング溶液中のヤギ抗TRPV1抗体(sc − 12498、1:100、Santa Cruz Biotechnology、Inc.、ハイデルベルク、ドイツ)と共に室温で1時間インキュベートした。インキュベーション後、切片を10分間3回洗浄し、二次ロバ抗ヤギAlexa Fluor-488抗体(A11055、1:500、Life Technologies、Alcobendas、スペイン)およびコンジュゲートマウス抗NeuNと共に1時間インキュベートした。抗体(MAB377A5、1:500、Merck Millipore、マドリード、スペイン)。次にスライスを10分間3回洗浄し、ProLong(登録商標) Gold Antifade Mountant(Life Technologies、Alcobendas、Spain)を用いてマウントした。共焦点レーザー走査型顕微鏡(Model A1、Nikon Instruments Europe BV、アムステルダム、オランダ)を用いて画像を取得した。
2.10 。データ分析
データをSigmaPlot 12.0プログラム(Systat Software Inc.、San Jose、CA、USA)で分析した。実験に応じて、二元配置反復測定分散分析(ANOVA)または一元配置分散分析を用いた。すべてのケースでStudent-Newman-Keuls事後検定が使用されました。平均値間の差は、P値が0.05未満のときに有意と見なした。
3 。結果
3.1 。CFA誘発性関節炎のマウスの行動表現型:握力、機械的異痛、体重および自発運動量
20または30μL /足首のCFAの投与は、炎症誘発後の最初の3日の間に、後肢握力の体積依存的減少(20μLについて約35%および30μLについて55%)を誘導した。どちらの用量群でも、より高い容量のCFAを投与した動物では回復期間はより長かったが、握力値は正常レベルに戻った(図 1A)。未処置(ナイーブ)動物および生理食塩水(30μL /足首)で関節周囲に処置したマウスは、21日間まで試験したどの時点でも握力に有意な変化を示さなかった(図1A)。
図1
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図1。関節周囲にCFAを注射したマウスの握力の欠如は、浮腫および限局性免疫浸潤を伴った。(A)ナイーブマウスおよび生理食塩水(30μL /足首)で処置した動物と比較した、CFA(20または30μL /足首)で処置した動物における後肢握力の時間経過。(B)CFAまたは生理食塩水の投与後の足首の厚さの増加(20または30μL /足首)。(C)30μL /足首の食塩水またはCFAで関節周囲に処置されたマウスの代表的な写真(それぞれ左および右のパネル)。(D)ヘマトキシリンおよびエオシン染色された脛骨足関節、滑膜の代表的な顕微鏡写真生理食塩水またはCFA(30μL /足首)の投与後のマウスの膜および足パッド。スケールバーは全てのパネルにおいて200μmを表す。値は平均値±標準誤差(1群あたり動物10〜12匹)である。(A)と(B)の統計的に有意な差:** P <0.01対ナイーブ動物の値((A)の二元配置反復分析ANOVAと(B)の一元配置分散分析)、その後にStudent – Newman– Keuls test)ナイーブ動物と生理食塩水処置マウスの値との間に統計的に有意な差はなかった。足首の腫脹および組織学的分析についてのデータは同じマウスから得た。 CFAは少なくとも21日間持続した持続性足首腫脹を誘発したが、これは投与量にも依存した。30μL /足首のCFAで処置した動物は、20μLを与えたものよりも太い足首を有したが、食塩水(30μL /足首)で処置した動物は足首の厚さの有意な増加を示さなかった(図1B)。残りの実験では、30 µLのCFA(または生理食塩水)/足首を使用しました。肉眼的には、生理食塩水処置動物は足の炎症の徴候を示さなかった(図1C、左パネル)。しかしながら、CFA処理マウスは、投与部位(足首関節)およびその近傍の領域に限定されるように見える顕著な炎症を有し、一方、足蹠は影響を受けるようには思われなかった(図1)。C右パネル)生理食塩水投与の2日後のマウスからの脛骨足関節、滑膜または足蹠の組織学的検査は、いかなる組織学的異常も明らかにしなかった(図1D上部パネル)。しかしながら、CFA投与の2日後、我々は、踵に及ぶ大量の関節周囲免疫浸潤物、ならびに関節内滲出液を伴う顕著な免疫浸潤物を特徴とする滑膜における炎症過程を見出したが、足蹠に組織学的変化は見られなかった。 1D、中央パネル)。CFA投与の21日後、動物は依然として踵および関節周囲構造に顕著な免疫浸潤を示したが、滑膜は免疫浸潤を示さず、そして目に見えるほどの関節内滲出液は観察されず、そして足パッドは影響を受けなかった(図1)。 D、下パネル)。 次に、足の炎症を起こした部分(踵)と炎症を起こしていない部分(パッド)の機械的閾値を測定しました。CFAを与えられたマウスは、踵においてフォンフレイ閾値の顕著な減少を示し、これは触覚異痛の存在を示し、そして減少は研究の経過(21日)を通して維持された(図2A)。関節の炎症は足蹠における機械的閾値の変化を誘発しなかった(図2A)。これは、感覚の変化が炎症領域に限定されるように思われることを示している。関節周囲に生理食塩水で処置した対照マウスは、踵または足パッドのいずれにおいてもそれらの機械的閾値の変化を示さなかった(図2A)。 図2 高解像度画像をダウンロードする(334KB)フルサイズの画像をダウンロード 図2。関節周囲にCFAを注射したマウスの機械的異痛症は、体重または自発運動量の平行変化を示さなかった。(A)関節周囲にCFAまたは生理食塩水で処置したマウスの踵および足パッドにおけるフォンフレイ閾値。(B)CFAまたは食塩水投与後の体重の時間経過。(C)関節周囲炎の誘発の1または2日後の、ナイーブマウスおよびCFA処置動物の垂直(後)および水平(移動距離)の自発運動活性。全ての実験において、30μL /足首の容量を使用した。値は平均値±標準誤差(1群あたり動物10〜12匹)である。統計学的有意差:(A)** P 各時点で踵内で炎症がある場合とない場合のマウスの値の間で<0.01(二元配置反復測定ANOVA、続いてスチューデント – ニューマン – クールズ検定)。(B)試験したどの時点においても生理食塩水またはCFA処置動物からの値の間に統計的に有意な差はない(二元配置反復測定ANOVA)。(C)未処置動物またはCFA処置動物からの値の間に統計的に有意な差がない(一元配置分散分析)。 我々はまた、我々の実験条件下での関節の炎症が、体重の変化や自発運動のような他の変化を引き起こしたかどうかを決定した。炎症を誘発した動物は、食塩水処置マウスと比較して体重の変化を示さなかった(図2B)。さらに、CFA投与は、対照マウスと比較して、垂直または水平運動活性のいずれにおいても変化を誘発しなかった(図2C)。したがって、これは、CFA投与が握力および機械的閾値の明らかな低下を誘発したが、それが動物の全身状態または全身運動性に有意に影響を及ぼさなかったことを示している。 3.2 。炎症誘発握力障害および触覚異痛症に対する従来の経口鎮痛薬の効果 握力不足が疼痛に関連しているかどうかをテストするために、我々は従来の鎮痛薬の効果を評価した。NSAID、イブプロフェンおよびセレコキシブ、ならびにアセトアミノフェンの経口投与は、関節の炎症を有する動物において握力の用量依存的な増加を生じた(それぞれ図3A、BおよびC)。3つ全ての薬物の最大効果は投与後90分でピークに達したが、この時点でさえ炎症を誘発したマウスにおける握力は十分に基礎値を回復することができなかった。その後、NSAIDまたはアセトアミノフェンによって誘発された関節の炎症を有する動物における握力の増加は徐々に回復した(図3)。A、B、C)本発明者らはまた、オピオイドトラマドールおよびオキシコドンの経口投与の効果を試験した(それぞれ 図4AおよびB)。これらの薬物は投与後45分でピークに達する身体機能の急速な回復を誘導し、それは時間と共に徐々に減少した。NSAIDまたはアセトアミノフェンの効果とは対照的に、トラマドールおよびオキシコドンの両方が、関節炎症を有するマウスにおいて握力障害からの完全な回復を誘導した(それぞれ図4AおよびB)。炎症が誘発されたマウスにおいて最大の効果を有する用量で投与された場合であっても、これらの鎮痛薬のいずれも炎症のない動物における握力値を変更することができなかった(図3A、BおよびCならびに図4)。AとB)。これらの結果は、試験した鎮痛薬が正常な運動機能を変えることよりもむしろ疼痛特異的効果によって改善された握力不足を示唆する。 図3 高解像度画像をダウンロード(1MB)フルサイズの画像をダウンロード 図3。CFAの関節周囲投与により誘発される握力欠損に対する経口NSAIDとアセトアミノフェンの効果 イブプロフェン(A)、セレコキシブ(B)、アセトアミノフェン(C)またはそれらの溶媒(イブプロフェンについてはHPMC、およびセレコキシブおよびアセトアミノフェンについてはHPMC中の1%Tween80)を、CFAまたは生理食塩水の投与の2日後に経口投与した。 30μL /足首)。値は平均値±標準誤差(1群あたり動物10〜12匹)である。(A)、(B)および(C)における統計的に有意な差:* 各時点で薬物または溶媒で処置された炎症を有するマウスからの値の間の*P<0.05。#P各時点 で、薬物溶媒で治療した炎症のないマウスと炎症のあるマウスからの値の間に0.05未満(二元配置反復測定ANOVA、続いてスチューデント – ニューマン – クールス検定)。明確にするために、P <0.01の有意性は二重記号で標識されていない。試験したどの時点においても、薬物またはそれらの溶媒で炎症を治療していないマウスの間に有意差はなかった。 図4 高解像度画像をダウンロード(766KB)フルサイズの画像をダウンロード 図4。CFAの関節周囲投与により誘発される握力欠乏に対する経口オピオイドの効果 トラマドール(A)、オキシコドン(B)またはそれらの溶媒(HPMC)を、CFAまたは食塩水(30μL /足首)の投与の2日後に経口(経口)投与した。値は平均値±標準誤差(1群あたり動物10〜12匹)である。(A)および(B)における統計的に有意な差:* 各時点で薬物または溶媒で処置した炎症を有するマウスからの値の間の*P<0.05。#P <マウスからの値と0.05で処理し、炎症なしの薬物溶媒各時点で炎症を起こしているマウス(二元配置反復測定ANOVAの後にスチューデント – ニューマン – クールス検定)。明確にするために、P <0.01の有意性は二重記号で標識されていない。試験したどの時点においても、薬物またはそれらの溶媒で炎症を治療していないマウスの間に有意差はなかった。 次に、グリップ力の回復に対する異なる薬物の効果の比較を容易にするために、最大効果時(NSAIDおよびアセトアミノフェンについては90分、オピオイド薬については45分)における薬物効果の用量反応曲線を構築した。関節炎のあるマウス イブプロフェン、セレコキシブおよびアセトアミノフェンの最大効果は、炎症前の値の約60%の握力の回復をもたらしたが、オピオイドオキシコドンまたはトラマドールで処置した動物では、握力は対照値の約90%に回復した(図5)。 A) 図5 高解像度画像をダウンロードする(358KB)フルサイズの画像をダウンロード 図5。CFAで関節周囲に処置したマウスにおける握力障害および触覚異痛に対する鎮痛薬の経口投与により誘発される効果の比較 (A)握力不足に対する鎮痛薬の効果、および(B)炎症を有する動物の踵におけるフォンフレイ閾値に対する。全ての場合において、薬物またはそれらの溶媒は、CFA投与の2日後に経口(p.o.)投与された(30μL /足首)。HPMCをイブプロフェン、トラマドールおよびオキシコドン(白色記号)の溶媒として使用し、そしてHPMC中1%Tween 80をセレコキシブおよびアセトアミノフェンについて使用した。(黒い記号)値は平均値±標準誤差(1群あたり動物10〜12匹)である。データは、各個々のマウスにおける0%効果を薬物投与直前に得られた値、100%効果がCFA注射前に得られた値を考慮して、握力の回復パーセントまたは抗異痛効果パーセントとして表される。トラマドールまたはオキシコドン投与の45分後、またはイブプロフェン、セレコキシブ、またはアセトアミノフェン投与の90分後に値を得た。(A)と(B)の統計的に有意な差: 薬物またはそれらの溶媒で治療された炎症を持つマウスからの値の間の * P <0.05、** P <0.01(一元配置分散分析後のStudent-Newman-Keuls検定) 。 次に、炎症が誘発されたマウスの触覚異痛に対するすべての薬物の効果を調べました。約60%の握力回復(それぞれ40 mg / kg、80 mg / kg、160 mg / kgおよび20 mg / kg)を誘導したイブプロフェン、セレコキシブ、アセトアミノフェンまたはトラマドールの用量は、いずれの場合も触覚異痛症に対する効果がなかった。 45〜240分の間に試験した時点(NSAIDおよびアセトアミノフェンについては図 1Aを、トラマドールについては図 1Bを補充する)。一方、オキシコドン4mg / kgは、45分で機械的異痛症の適度ではあるが有意な改善を誘発し(補足図1B)、それは握力不足に対するピーク効果と一致した(図4)。B)。この効果は急速に消滅したが、これは90分間持続した握力不足に対する効果のより長い持続期間とは対照的である(補足図 1Bおよび図 4B)。NSAIDおよびアセトアミノフェンの90分の時間だけ点握力および機械的異痛の回復にこれらの薬剤の効果の比較、およびオピオイド薬の45分を容易にするために、に示されている図5 B.ときに我々これらの薬の投与量を2倍にすると、それらすべてが触覚性異痛を改善することができました(図 5B)。したがって、試験したすべての鎮痛薬は身体機能と触覚性異痛の両方を改善することができたが、握力は触覚性異痛より薬物誘発性鎮痛のより敏感な指標であった。 3.3 。筋肉弛緩性バクロフェンの炎症誘発握力障害および機械的異痛症に対する効果 運動障害が握力と触覚異痛に 及ぼす影響を判断するために、筋弛緩性バクロフェンの効果を調べました。この薬物は、握力と触覚異痛に対して反対の効果を誘発した:それは、炎症を有するマウスにおいてフォンフレイ閾値を用量依存的に増加させ、顕著な抗疼痛様効果を(オキシコドンと同程度まで)誘発し、握力障害を改善しなかった。しかし、この機能的尺度において平行した減少を誘導した(図6)。さらに、バクロフェンの活性用量はまた、非損傷動物において握力を減少させた(データは示さず)。 図6 高解像度画像をダウンロード(146KB)フルサイズの画像をダウンロード 図6。関節周囲にCFAで処置したマウスにおける握力障害および触覚異痛に対するバクロフェンの経口投与によって誘発される効果の比較。バクロフェンまたはその溶媒(HPMC)を、CFA投与の2日後に経口(p.o.)投与した(30μL /足首)。値は平均値±標準誤差(1群あたり動物10〜12匹)である。データは、薬物投与直前に得られた値を0%として、および各個々のマウスにおけるCFA注射前に得られた値を100%として、握力の回復率または抗異痛効果の%として表した。すべての値は、バクロフェンまたはその溶媒の投与から45分後に得られた。統計的に有意な差:* P <0.05、** P <0.01、薬物またはそれらの溶媒で治療された炎症を有するマウスからの値の間(一元配置分散分析後のスチューデント – ニューマン – クールス検定)。 3.4 。炎症誘発握力障害および機械的異痛症に対するTRP拮抗薬ルテニウムレッドの効果 また、炎症時の握力の欠如と機械的異痛がTRP拮抗薬ルテニウムレッドに敏感かどうかを評価しました。この化合物の全身投与(1〜2 mg / kg)は、30分から180分の間に試験されたどの時点においても、損傷マウスまたは非損傷マウスの握力に影響を及ぼさなかった(補足 図2)。明確にするために、投与後30分の2mg / kgについてのデータのみを図7Aに示す。しかしながら、ルテニウムレッド(行動評価の30分前に投与)は、用量依存的に、機械的に廃止することができた。炎症を有するが非損傷マウスの機械的閾値に影響を与えないマウスにおける異痛症(図7)。B)。それは顕著な副作用を誘発したので、我々は高用量のルテニウムレッド(4 mg / kg)をテストすることができませんでした。握力不足と触覚異痛に対するルテニウムレッドの異なる効果は、それらのメカニズムが異なることを示唆している。 図7 高解像度画像をダウンロードする(285KB)フルサイズの画像をダウンロード 図7。CFAで関節周囲に処置したマウスにおける握力の欠損およびvon Freyの閾値に対するルテニウムレッドの皮下投与の効果。(A)CFAによって誘発された握力欠損に対するルテニウムレッド(RR)の効果の欠如。(B)行動評価の30分前に投与されたRRは、CFAによって誘発されたフォンフレイ閾値の減少を軽減した。RRまたはその溶媒(生理食塩水)をCFA投与の2日後に皮下(sc)投与した(30μL/足首)。値は平均値±標準誤差(1群あたり動物10〜12匹)である。(A)および(B)における統計的に有意な差:** ルテニウムレッドまたはその溶媒で処置された炎症の有無によるマウスからの値の間のP<0.01。## P ルテニウムレッドまたはその溶媒で処理された炎症を有するマウスからの値の間で<0.01(一元配置分散分析後にスチューデント – ニューマン – クールス検定)。 3.5 。炎症誘発握力障害および触覚異痛症に対するTRPV1発現ニューロンの寄与 炎症中の握力の欠如および機械的異痛が同じタイプの侵害受容ニューロンに依存するかどうかを調べるために、我々は、握力およびTRPV1発現ニューロンのインビボアブレーションの機械的閾値に対する効果を比較した。TRPV1の染色は、中に存在するSOMAの小さいDRGニューロンのと表層における脊髄後角の(にコントロール参照図8の A及びBのそれぞれ)。RTX治療後、DRG(図 8A)または脊髄後角(図 8A)のいずれにおいてもTRPV1染色を検出することはできなかった。B)、その中央末端を含むTRPV1発現ニューロンの切除を反映する。この侵害受容性集団の切除は、非損傷マウスにおいて握力または機械的閾値のいずれにも影響を及ぼさなかった(それぞれ図8CおよびD)。しかしながら、それはそれらの握力の欠損に影響を及ぼさなかったが(図8C)、炎症を有するマウスにおける機械的異痛症の発症を防ぐことができた(図8D)。したがって、関節の炎症中の握力の欠如およびフォンフレイ閾値の低下は、一次求心性神経の異なる集団の参加を含む。 図8 高解像度画像をダウンロード(1MB)フルサイズの画像をダウンロード 図8。関節周囲にCFAで処置したマウスにおけるグリップ強度の欠損およびvon Frey閾値に対するTRPV1発現ニューロンの除去の異なる効果。(A)および(B)CFA処置マウスからのL4後根神経節(DRG)および脊髄(SC)腰椎拡大部におけるNeuN(赤)およびTRPV1(緑)の二重標識。上のパネル:食塩水処理マウスからの試料(対照)。下のパネル:レジシフェラトキシンで処理したマウスからのサンプル(RTX)スケールバーは100μmを表す。(C)CFAによって誘発された握力不足に対するRTXの効果の欠如。(D)RTXは、CFAによって誘発されたフォンフレイ閾値の減少を軽減した。RTX(50μg / kg)またはその溶媒で処置したマウスにおいて、試料採取および行動試験を、CFAまたは食塩水(30μL /足首)の関節周囲投与の2日後に行った。値は平均値±標準誤差(1群あたり動物10〜12匹)である。(C)および(D)の統計的に有意な差:** RTXまたはその溶媒で処置した炎症の有無によるマウスからの値の間のP<0.01。##P RTXまたはその溶媒で治療された炎症を有するマウスからの値の間で<0.01(一元配置分散分析後にスチューデント – ニューマン – クールス検定)。行動および免疫蛍光アッセイに同じマウスを使用した。 4 。討論 この研究では、実験的に誘発された関節の炎症を持つマウスで、握力が著しくそして長期間減少したことを示します。炎症領域における握力不足および機械的異痛症(von Freyフィラメントを用いて測定)は、それらの進化の経過および従来の鎮痛薬に対するそれらの感受性の両方において異なっていた。さらに、触覚異痛症はルテニウムレッドまたはTRPV1を発現するニューロンの除去によって廃止されたが、関節炎のあるマウスにおける握力の欠如はそうではなかったことを示す。 後者は機能障害より長く持続したので、握力障害および機械的異痛からの回復の時間経過は異なった。これら2つの結果における進化の異なる時間経過は、炎症領域における顕著な触覚過敏性が必ずしも身体機能の有意な変化を意味するわけではないことを示している。足関節におけるCFAの関節周囲投与は、顕著で長期にわたる足首の腫脹を誘発したことを示す。。しかし、この持続的な足首の腫れは、期間が異なる組織学的変化を伴っていた。滑膜の炎症過程(すなわち、免疫浸潤および関節内浸出液)および握力欠損は炎症が誘発された2日後に顕著であったが、それらは両方ともCFA注射の21日後に弱まった。これらの結果は、滑膜の変化が観察された機能障害に関連している可能性があることを示唆しており、これに関連して、滑膜炎は関節機能障害と疼痛の両方とヒトの研究において強く関連している(Rice et al。、2015、Scanzello and Goldring、2012に概説)。、Scottら、2000年。)本発明者らの実験条件下では、炎症を有するマウスにおける免疫浸潤は踵にまで広がり、足のこの領域における機械的異痛症と同様に(滑膜の回復および握力とは対照的に)研究期間全体を通して顕著であった。免疫細胞は炎症性皮膚異痛症において中心的な役割を果たすことが知られているので(Ghasemlou et al。、2015 )、かかとの持続的な免疫浸潤は我々のマウスで検出された長期の触覚過敏症に寄与する可能性がある。これらの結果は、機能障害と触覚異痛を引き起こす組織学的変化が異なることを示唆している。関節周囲CFA誘発性炎症を有するマウスの足蹠に観察可能な組織学的変化または感覚的変化は検出されなかった。この観察に関して注目すべきことは、マウスが足のこの部分で力変換器に接続された金属棒を握ったことであり、したがって、炎症を有する動物において握力に見られる欠陥は足パッド感受性の変化によるものではない。この領域で異痛症を発症することはありませんが、代わりに握っている間に炎症を起こした関節の動きや緊張の結果である可能性があります。 痛みの状態は、体重げっ歯類のゲイン(削減することができブラックバーン・マンロー、2004下肢が負傷しているとき(によって審査)とその探索活動、特にその垂直活動(飼育)をコボスとポルティージョ-Salido、2013)。関節の炎症を有するマウスは、それらの著しい握力の欠陥にもかかわらず、体重増加または探索的活動における変化を示さなかったことを我々は見出した。これらの結果は、握力不足が他の疼痛関連の転帰よりも機能的変化のより敏感な指標であることを示している。 握力の低下が疼痛に関連しているかどうかを調べるために、我々はヒトの臨床治療に使用される経口投与された鎮痛薬の効果を調べた。NSAID、イブプロフェンおよびセレコキシブ、ならびにアセトアミノフェンは、握力不足からの有意ではあるが限られた回復を誘発した。しかし、オピオイドのトラマドールとオキシコドンは、関節の炎症によって引き起こされる機能障害を完全に元に戻すことができました。握力の回復におけるNSAIDまたはアセトアミノフェンと比較してオピオイドのより高い有効性は、ヒト患者におけるこれらの薬物の鎮痛有効性と一致している、とWHO鎮痛ラダー( Sarzi-Puttini et al。、2012)は述べている。; それ故、我々の実験動物における関節の炎症の間の握力の変化は主に痛みに起因する。マウスにおける疼痛と握力の欠如との間のこの関連は、関節痛を有する患者における同じ結果尺度による疼痛と障害との間の既知の相関と一致する(例えば、 Fraserら、1999、Overendら、1999)鎮痛薬治療に対する感受性は、握力回復と機械的異痛の間で異なりました:前者は後者より鎮痛薬の効果のより敏感な指標でした。私たちの知る限りでは、疼痛の結果の尺度として握力を使用した初期の研究では、触覚過敏症および握力の不足による薬物の影響に対する異なる感受性については検討されていません。薬物誘発鎮痛の効果を反映する点で触覚異痛と比較して握力の感度が高いことは、負傷した足の体重負荷の変化、探索的な歩行、陥没行動などのげっ歯類の身体機能の他の尺度との以前の研究と一致するまたはホイールランニング(Andrews et al。、2012、Cobosら、2012年、Huntjensら、2009年、Matsonら、2007年)。したがって、以前に示唆されているように、薬物誘発性鎮痛薬に対するより高い感受性は、これらのタイプのより「自然な」疼痛対策に固有の品質である可能性がある(Cobos and Portillo-Salido、2013、De la Puente et al。、2015)。これは、鎮痛薬の発見に特に関連し得る。なぜなら、それらは、現在日常的に評価されていない疼痛の機能的尺度を改善するかもしれないが、触覚異痛に対する有効性の欠如に基づいて廃棄されるからである。 重要なことに、我々が試験した鎮痛薬のいずれも炎症のない動物において修正された握力を示さず、それ故関節炎を有するマウスにおける握力の回復は正常な握力に対する非特異的薬物効果によるものではなかった。 薬物は、鎮静作用および運動作用による疼痛様反射を抑制し、偽陽性の結果をもたらす可能性があります。ここで我々は、バクロフェンが炎症を有するマウスにおいてフォンフレイ閾値の顕著な増加を誘導し、そしてその効果が第三段階オピオイドオキシコドンのそれと類似していたことを示す。しかしながら、本発明者らは、この薬物の「抗アロディニック」用量もまた、炎症の有無にかかわらずマウスの握力を低下させることを見出した。これは、炎症性機械的異痛症に対するバクロフェンによって誘発される効果が、この薬物の既知の運動障害および鎮静効果によるものであることを示唆している( Dario and Tomei、2004)。よりもむしろ本当の鎮痛効果に。したがって、グリップ強度とフォンフレイしきい値は、同じ交絡者による同じような影響を受けません。薬物誘発性運動障害がフォンフレイ試験において誤った鎮痛剤様効果をもたらす可能性がある一方で、疼痛の代用尺度として握力の試験においてこの効果を有することは期待されないであろう。鎮痛薬の発見には、薬物が毒性の徴候を引き起こすかどうかを判断することが不可欠です。強度は、薬剤誘発毒性(試験するために、ヒトにおいて使用されてきたグリップSavilampiら、2014 )、古典的に評価するために使用される神経毒性を齧歯類に(メイヤーら。、1979)ともアーウィン画面に含まれている(アーウィン1968年;Mattsson et al。、1996これは、製薬業界に、薬物誘発性神経毒性作用を検出するための前臨床試験の第一段階として組み込まれている(Moser、2011)。したがって、この結果の測定は、薬物誘発性鎮痛作用および毒性の両方を検出するために使用することができ、これは前臨床開発中に試験されている薬物の治療指数を決定するために間違いなく有利である。 鎮痛治療に対する握力不足および触覚性異痛症の異なる反応は、それらの時間経過における前述の相違と共に、異なるメカニズムが機械的異痛症および関節痛誘発性機能障害の出現に関与しているという概念を支持する。事実、我々は、非選択的TRP拮抗薬ルテニウムレッドが炎症性触覚異痛症を廃止することができたが、握力不足を改善することなく示した。ルテニウムレッドを用いた我々の結果は、多様な病因からの触覚異痛症に対する以前に報告された効果と一致する(Cuiら、2014年、Quら、2016年、Shinodaら、2008年)。ルテニウムレッドは、広く使用されているTRP拮抗薬である(例えば、St Pierre et al。、2009)。しかしながら、それはまた機械感受性のピエゾチャンネルを含む他のチャンネルを遮断する(Coste et al。、2012 )。我々の結果は、接触性アロディニアとグリップ力の赤字は、この化合物によって同じように影響されないことを示している(したがって、そのメカニズムが異なることを示唆している)が、そのため、これは決定的にリンクしていないTRPチャネルを、我々が観察された効果に。 それから、我々はいくつかのTRPチャンネルを発現することが知られているTRPV1 +ニューロンの機能を標的とした(Julius、2013 )。我々の研究では、これらのTRPV1発現感覚ニューロンの切除は正常な機械的閾値を変えなかったが、炎症性関節炎の間の皮膚痛過敏症におけるTRPV1ニューロンの既知の極めて重要な役割と一致する触覚異痛を完全に弱めた。 2015)。しかし、我々は関節の炎症によって誘発される握力の欠如には効果がないことを見出し、TRV1を発現するニューロンが観察された機能的な欠陥の原因ではないことを示している。握力は、変形性関節症性疼痛における疼痛誘発性障害の指標として以前から使用されている(Chandranら、2009年、Honoreら、2009年)。TRPV1拮抗作用は、実験的変形性関節症のげっ歯類における握力不足を改善することができると報告されている(Honore et al。、2009 )。変形性関節症は古典的には「非炎症性関節炎」と考えられており(例Haroon et al。、2016)、変形性関節症は炎症性成分を持つと現在考えられているが(Sokolove and Lepus、2013)、これは我々のCFAほど顕著ではない。処置マウス。したがって、我々の調査結果と以前の報告との違いは、調べた関節痛の種類の違いに起因している可能性があります。 TRPV1は、マウスDRG中のほとんど全ての無髄(C型)ペプチド作動性ニューロンに存在する(Cavanaugh et al。、2011 )が、Aニューロンにはほとんど存在せず、C非ペプチド作動性侵害受容体には実質的に存在しない(例えばCavanaugh et al。 2011 ; Niiyama et al。、2007)。したがって、AδまたはC非ペプチド作動性ニューロン(TRPV1をほとんどまたは全く発現しない)などのCペプチド作動性侵害受容器とは異なる他の侵害受容ニューロン(例えば、Niiyamaら、2007)は、関節炎症中の握力の低下に寄与する。別の説明は、関節組織はまた、(例えば中枢機構を介して痛みにつながる可能性疼痛状態の下で固有受容、によって神経支配されていること、1995 MAPP)関節の炎症の間の握力の不足に関与する正確なメカニズムに関係なく、関節の炎症の間の触覚の異痛および機能障害に対するルテニウムレッドおよびTRPV1発現ニューロンの除去の異なる効果は、それらの生物学的メカニズムが異なるという考えを強く支持する。 5 。結論 関節の炎症の間に握力の不足を監視することは、げっ歯類の炎症性関節痛の信頼できる尺度であると結論付けています。握力は、鎮痛薬治療の有効性ならびに薬物誘発性神経毒性作用の出現または重症度(前臨床鎮痛薬開発における著名な交絡者)を特徴付けるために使用することができ、学術研究室および製薬業界で容易に使用することができる。 。炎症時の握力障害および触覚異痛に関与する神経生物学的メカニズムは異なり、したがって皮膚過敏症の尺度で得られた結果前臨床薬試験において単独で炎症性関節痛による機能障害を直接推定することはできない。握力の不足の評価は、臨床診療で広く使用されているパラメータのげっ歯類における尺度を提供することによって、新しい疼痛標的および鎮痛薬候補の前臨床評価の信頼性を改善する可能性を秘めている。 利益相反 著者は、利益相反がないことを宣言しています。 謝辞 原稿中の英語の使用を改善してくれたK. Shashokに感謝します。MA Tejadaは、グラナダ大学からの博士研究助成金によって支援されていました。EJ Cobosはグラナダ大学の研究プログラムによって支援されました。この研究は、スペインの経済競争力省(MINECO、助成金SAF2013-47481P)、Junta deAndalucía(助成金CTS 109)、およびEsteveおよび欧州地域開発基金(FEDER)からの資金援助によって部分的に支援されました。この研究は、AMGの博士論文の要件を部分的に満たすことで行われました。 付録A 。補足データ 以下は、この記事に関連する補足データです。 Word文書のダウンロード(627KB)docxファイルに関するヘルプ 補足図。 参考文献 Andrews et al。、2012 N. アンドリュース、E. レッグ、D. Lisak 、Y. Issop 、D. リチャードソン、S. ハーパー、T. Pheby 、W. 黄、G. バージェス、I. マ、AS ライス ラットの自発掘り進む挙動が低減されます末梢神経損傷または炎症関連疼痛による ユーロ。J.Pain 、16 (2012 )、485 – 495 頁 Scopus Google ScholarのCrossRef ビューレコード 2015年バレット JE バレット 痛みの痛み:動物行動モデルの挑戦 ユーロ。J.Pharmacol​​。、753 (2015 )、頁183 – 190 記事のダウンロードPDFを見るScopus Google Scholar 2001年ベネット M. ベネット LANSS疼痛尺度:神経障害性症状と徴候のリーズ評価 Pain 、92 (2001 )、pp。147 – 157 記事のダウンロードPDF CrossRef Scopusでの記録を見るGoogle Scholar Bijlsmaら、1987 JW Bijlsma 、O. Huber-Bruning 、JH Thijssen 関節リウマチの臨床的および実験的症状に対するエストロゲン治療の効果 アン。Rheum Dis。、46 (1987 )、PP。777 – 779 Scopus Google ScholarのCrossRef ビューレコード ブラックバーン – マンロー、2004 G. 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