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概要
目的
本研究は、カンナビノイド−2(CB2)受容体アゴニストGW405833の局所投与が、対照ラット膝関節および変形性関節症(OA)の動物モデルにおいて関節侵害受容を調節できるかどうかを調べた。
方法
OAは雄Wistarラットにモノヨード酢酸ナトリウムの関節内注射により14日間の回復期間で誘導された。免疫組織化学を用いて、偽 – およびモノ – ヨード酢酸ナトリウム(MIA)処置動物の後根神経節(DRG)ならびに滑膜におけるCB2および一過性受容体電位バニロイドチャネル-1(TRPV1)受容体の発現を評価した。電気生理学的記録を、異なる用量のGW405833の動脈内注射前後の関節の回転に応答して膝関節の一次求心性神経から行った。関節痛に対する関節内GW405833の効果 知覚は後肢機能不全によって決定された。in vitroでのニューロン放出アッセイは、 GW405833は、炎症性の放出に起因かどうかを確認するために使用された神経ペプチド( – CGRP、カルシトニン遺伝子関連ペプチド)。
結果
CB2およびTRPV 1受容体は、偽処置動物およびMIA処置動物の両方において、DRGニューロンおよび滑膜細胞に共局在していた。GW405833の局所適用は、対照膝における関節求心性発射率を最大31%まで有意に減少させた。しかし、OA膝関節では、GW405833は関節の機械受容体に対して顕著な感作効果を示しました。GW405833とCB 2 受容体アンタゴニスト AM630の同時投与またはTRPV1イオンチャネルアンタゴニストSB366791の予備投与は、GW405833の感作効果を減弱させた。疼痛試験において、OA膝関節へのGW405833の関節内注射は、後肢機能不全を増強したが、食塩水を注射した対照関節における疼痛行動には影響を及ぼさなかった。GW405833は、TRPV1チャネル依存性メカニズムを介してCGRP放出の増加を誘発した。
結論
これらのデータは、GW405833が対照関節において求心性神経線維の機械的感受性を低下させるが、OA関節において侵害受容反応を引き起こすことを示している。GW405833の観察された侵害受容作用はTRPV1受容体を含むと思われる。
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キーワード
関節痛変形性関節症カンナビノイドCB 2受容体電気生理学的記録動物モデル一過性受容体電位バニロイドチャネル1主な共同求心性神経
前書き
変形性関節症(OA)は、関節炎の最も一般的な形態であり、軟骨下骨の広範なリモデリングおよび関節痛をもたらす関節軟骨の永久的破壊によって特徴付けられる。現在のところ、疾患修飾薬は入手できません。したがって、OAの治療は主に鎮痛薬に限定されており、鎮痛薬の有効性や危険な副作用は限られていることがよくあります。OA疼痛の確立された動物モデルは、関節内注射を伴う解糖の病変のようなOAにつながる、軟骨代謝を崩壊阻害剤、ナトリウムモノヨードアセテート(MIA)を1、2、3、4、5、神経感や関節痛6、7。
慢性疼痛の治療に非常に有望視されている薬剤のファミリーはカンナビノイドです。カンナビノイドアゴニストは、侵害受容伝達を抑制し、関節炎の痛みの異なるモデルにおいて疼痛関連行動を抑制 7、8、9、10 。2つのカンナビノイド受容体、カンナビノイド受容体1(CB1受容体)およびカンナビノイド受容体2(CB2受容体)がクローニングされ特徴付けられている。CB1受容体は中枢および末梢神経系に存在し、一方CB2受容体は中枢神経系および末梢神経系に存在する。受容体は主に免疫系に関連付けられている11、12。
潜在的な抗炎症および鎮痛作用 CBの2つの特異的なカンナビノイドアゴニストは、様々な疼痛モデルで試験されている13、14、15、16、17、18。現在のカンナビノイド疼痛治療法は中枢神経系(CNS)を介した副作用によってしばしば制限されます。しかし、選択的CB 2受容体アゴニストは、このような効果を欠いていることが示されている14、18、19。全身投与した場合、CB2受容体アゴニストGW405833は炎症および痛覚過敏を部分的に逆転させた。複数の急性炎症モデルで見つかった20、21。
カンナビノイド受容体でのアゴニストリガンドであることに加えて、いくつかのカンナビノイドはまた、活性化剤である一過性受容体電位バニロイドチャネル-1(TRPV1)22、23、24、25 。TRPV1は侵害受容性に発現している求心性ニューロン周にわたってとの誘導に重要な役割を果たしていることが実証された熱痛覚過敏における炎症性疼痛のモデル 26、27、28 。いくつかの研究は、TRPV1チャンネルがCBの抗侵害受容効果の媒介に関与していることを示した。1つのアゴニスト22、24、27、28、29 。このように、特定のカンナビノイドは、特に炎症性痛覚過敏の条件下で、二重カンナビノイド – バニロイドメディエータとして作用する可能性があります。
この研究は、CB2受容体アゴニストGW405833の局所適用が、対照およびMIA処置ラット膝関節における求心性神経線維の侵害受容活性および疼痛行動を低減できるかどうかを調べた。侵害受容促進性神経伝達物質カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)は関節の機械侵害受容を中枢に30変調し、CGRPノックアウト関節炎マウスは二次痛覚過敏を発症しない31ので、我々はネイティブでGW405833活性を調べるために脊髄ホモジネートからのCGRPの放出を調べた。 TRPV1受容体32。受容体の活性化は、正常状態および罹患状態をそれぞれシミュレートするために、基底状態および刺激/リン酸化状態の両方で測定された。
方法
動物たち
実験は217匹の雄Wistarラット(250〜450 g)で行った。本研究で概説した動物の取り扱いおよび外科的処置はすべて、動物の倫理も検討している実験動物の世話および使用に関するカナダ評議会のガイドラインに従った。
OAのMIAモデル
53匹のラットを100%O2中2%イソフルラン( 1L /分)で深く麻酔した。OAを誘発するために、0.9%食塩水中の3mgのMIAナトリウム 50μlを膝蓋靭帯を通して関節腔に注射した。動物は一貫して、この種に深刻末期OAを引き起こすことが示されている14日間回復させた 1、4、5。さらに42匹の動物において、50μlの食塩水を膝関節に注射し、そしてこのコホートを偽対照群として役立てた。
免疫組織化学
偽注射された(n=4)およびMIA注射された(n=4)雄性ウィスターラット由来のDRGおよび滑膜において、CB2およびTRPV1の発現を評価した。動物を麻酔し、食塩水、続いてリン酸緩衝食塩水(PBS)中の4%パラホルムアルデヒド(PFA)、pH7.4で経心的に灌流した。DRG(L4〜L6)および滑膜を解剖し、室温で3時間4%PFA / PBS溶液中で後固定し、次いで30%スクロース/ PBS溶液に移し、そして4℃で一晩維持した。次いで、組織をM1包埋媒体(Thermo Shandon、Pittsburgh、PA、USA)にマウントし、そして-80℃で保存した。セクション12〜14 μmをクリオスタット上の固定組織から切り取り、Superfrost Plus顕微鏡スライド(Fisher Scientific、Pittsburgh、PA、USA)上に連続的にマウントした。室温に平衡化した後、切片を、1%BSA、0.1%トリトンX100および10%を含有するTween 20洗浄緩衝液(Dako、Carpinteria、CA、USA)を含む1 ×Dako Tris緩衝食塩水で1時間内因性タンパク質についてブロックした。二次抗体の宿主種の正常血清。切片を、ウサギ抗CB2の一次抗体のカクテルと共に4℃で一晩インキュベートした。 (米国インディアナ州ブルーミントンのインディアナ大学ケンマッキー博士からの贈与)および滑膜用のモルモット抗TRPV1(米国ニューメキシコ州エディナのGP14100)またはDRG用のヤギ抗TRPV1(サンタクルーズ、SC − 12498)。その後、翌朝1×洗浄緩衝液で数回洗浄した。ブロッキングペプチド(CB2)または一次抗体の省略(TRPV1)を用いて陰性染色を確認した。次に切片を1時間インキュベートした。 滑膜用のヤギ抗モルモットAlexa 594およびヤギ抗ウサギAlexa 488のカクテル、ならびにDRG用のロバ抗ヤギAlexa 594およびロバ抗ウサギ488のカクテルを用いて室温で1時間。全ての二次抗体は、Molecular Probes(Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)からのものであった。1×洗浄緩衝液で数回洗浄した後、スライドを蛍光封入剤でカバースリップし、後の分析のために4℃で暗所に保存した。適切なフィルターブロックを備えたLeica蛍光顕微鏡(Bannockburn、IL、USA)で標識化を可視化した。併合画像は、Spotソフトウェア(Diagnostic Instruments、Sterling Heights、MI、USA)の機能を用いた単一ラベルファイルの合成物であった。DRGの場合
外科処置
外科的処置のための詳細な方法は以前に記載されている7。ラットをウレタン(25%原液; 2g / kg、腹腔内)で 深く麻酔した。左頸静脈にカニューレを挿入し、筋肉弛緩剤ガラミントリチオジド(50mg / kg)を注射して後肢筋肉組織から生じる神経干渉を排除した。右伏在動脈を膝関節の下にカニューレ挿入して局所的な動脈内への局所注射を可能にした。膝関節への薬の投与。右後足を力変換器およびトルク計に接続された靴のようなホルダーの中に入れることによって回転トルクを膝関節に加えた。
細胞外電気生理学的記録
関節からの求心性活動を記録するために使用される技術の神経線維ラットの膝関節には、以前に記載されている33、34 。伏在神経を単離した鼠径部および脊髄媒介性の発生防止のために中央カット反射します。次いで、神経ストランドを白金電極上に置き、単一の求心性線維活性を記録した。無関係な電極は筋肉組織に置かれた銀線電極でした同側後肢の。繊維の受容野は、ガラス棒を用いた膝関節の穏やかなプロービングに対する反応の誘発によって同定された。各記録された関節求心性神経の機械的閾値は、繊維が活動電位の誘発を開始するまで関節に加えられたトルクの漸増によって決定された。関節求心性神経の機械的感受性は、膝関節の外側への無害な回転および有害な過回転に応じて測定された。適用された薬物の効果に関して2つの動きの間に差異は観察されなかったので、両方の回転動きについてのデータを統計分析のためにプールした。関節の回転中に加えられる力の量は15から25の間の範囲 無害な移動の場合はmNm、無害な移動の場合は35〜45 mNmです。各繊維について活性の基準基準線レベルを確立するために、実験開始時に膝から個別のトルクレベルまでの3つの運動サイクルを実施し、平均求心性発火率を基準線活性とした。ベースラインと比較した発火率の変化率は、ビヒクルまたはGW405833(10 -12 mol; 10 -10 mol; 10 -8 mol; 100μlボーラス)のいずれかを動脈内に密接に注射した後に計算した。別の群の動物においては、CB2受容体アンタゴニストAM630(10-8mol;100μlボーラス)またはTRPV1。 関節の機械的感受性におけるカンナビノイドおよび/またはTRPV1受容体の関与を確認するために、GW405833の30分前に受容体アンタゴニストSB366791(500μg / kg、腹腔内)を投与した。GW405833の投与量は、カンナビノイド作動薬に関する我々の以前の経験に基づいて選択された7。神経線維の伝導速度は、一対の双極銀ワイヤ電極を用いてそれらの受容野を電気的に刺激することによって決定した。伝導速度が2m / s未満の求心性神経は髄鞘形成しないIV型線維として分類され、伝導速度が2m / s超の求心性神経は髄鞘が薄いIII型線維として分類された。
体重負荷評価
行動試験の前の3日間連続して、ラットを定期的に取り扱い、試験装置に徐々に慣れさせた。後肢体重負荷は、二重チャンネル体重平均器からなるインキャパシタンステスター(Linton、Norfolk、UK)を用いて決定した。各後肢によって及ぼされる力(グラムで測定)を5 秒間にわたって平均した。各データポイントは3つの読みの平均です。処置された(同側)後肢上のパーセント体重分布を計算した。MIA動物については、処置(GW405833の関節内注射:10-6 mol;100μlボーラス)と反対側の未処置後肢との間の体重分布を測定した。拮抗薬試験のために、TRPV1拮抗薬SB366791(500) GW405833の投与の30分前に、μg / kg(腹腔内)またはCB2受容体拮抗薬AM630(10-8 mol; 100μlボーラス)を注射した 。
CGRP放出アッセイ
成体雄性ラットをCO2に曝した後に頸椎脱臼さ せることにより屠殺した。脊髄の腰部(L1〜L6)を解剖し、 1つの臍帯あたり15mlの氷冷クレブス緩衝液中でホモジナイズした。ホモジネートを 5mg / mlに希釈し、96ウェルフィルタープレートに蒔いた(100μl /ウェル)。TRPV1受容体のリン酸化は、低濃度(10nM)のホルボール12,13−ジブチレート(PDBu)の添加によるプロテインキナーゼCの活性化によって達成された。緩衝液を真空濾過により除去し、PDBuおよび/または拮抗薬を含むまたは含まない緩衝液を加え(100μl /ウェル)、プレートを37℃で10分間インキュベートした。 分 PDBuおよび/またはアンタゴニストを含むまたは含まないアゴニストを添加し( 100μl /ウェル)、プレートを37℃でさらに10分間インキュベートした。次いで緩衝液をイムノプレート(SpiBio、Montigny Le Bretonneux、フランス)に移した。抗CGRPトレーサーを全てのウェルに添加し(100μl /ウェル)、プレートをプラスチックフィルムで覆い、そして4℃で16〜20時間インキュベートした。インキュベーション期間の後、プレートを洗浄緩衝液(300μl /ウェル)で洗浄し、エルマン試薬を添加した(200μl /ウェル)。プレートを室温に放置して45分間発色させ、405nmで吸光度を読み取った。データは、300nM カプサイシンの百分率として表した。 対照および曲線は、4パラメータHill方程式を用いてフィットさせた。
薬と試薬
ナトリウムMIA、GW405833、AM630、SB366791は、Tocris Bioscience(米国ミズーリ州;英国、ブリストル)から入手した。ガラミントリチオヨージド、PDBu、カプサイシン、DMSO、クレモフォアおよびウレタンは、Sigma − Aldrich(カナダのオンタリオ州;英国のプール)から入手した。全ての試薬をビヒクル溶液(2%DMSO、1%クレモフォア、0.9%食塩水)に溶解し、必要になるまで薬物のアリコートをエッペンドルフバイアル中で凍結(-20℃)させた。求心性神経線維に対する増感因子としての酸性度を排除するために、すべての溶液のpHを決定した。全ての溶液は注射前に中性pH(pH7.4)を有することが見出された。CGRP放出アッセイについては、薬物は10℃で溶解した。 100%DMSO中のmMで希釈し、次いでクレブス緩衝液で希釈する。実験当日にガラミントリチオヨージドを新しくし、そして0.9%食塩水中に溶解した。
統計
すべてのデータは正規分布しており、「n 」回の観測について95%信頼区間(CI – 下限、上限)の平均として表現されています。動物群間で投与された薬物の効果を、試験後のBonferroniの多重比較および対応のないスチューデントのt 検定を用いて、一元配置または二元配置分散分析(ANOVA)によって分析した。GW405833の時間経過と用量依存性は、一元配置分散分析によって検定され、個々の点は一標本t検定を用いて対照と比較されました。GW405833の最大効力(E max )によって生じる最大反応は、用量反応曲線から算出した。全ての差は、0.05未満のP値で統計的に有意と見なされた。
結果
対照およびMIA処理動物のDRGおよび滑膜におけるCB 2およびTRPV 1受容体の共局在
以前の結果と一致して、CB2抗体染色は、偽処置動物およびMIA処置動物の両方のDRG中の小、中および大直径のニューロンにおいて観察された[図1(A)。補足図1(A)]。これに対して、TRPV1 抗体標識は、両方の動物群において、主に小細胞および中細胞に限定されていた[図1(B)。補足図1(B)]。さらに、TRPV1染色は、生理食塩水およびMIA処理ラットからのDRG中の約25%のCB2陽性染色細胞において明らかであった[図1(C); C。補足図1(C)]。
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図1。偽注射した対照ラットDRG細胞(A〜C)および滑膜( D〜F)におけるCB 2 抗体とTRPV1抗体の共局在。CB2(緑色:A)およびTRPV1(赤色:B)抗体染色は、腰部DRG細胞において明らかである。CB2染色は、小、中および大径のDGR細胞において明らかであり、一方TRPV1発現は、主に小および中サイズの細胞において見られる。併合画像(C)は、中小サイズの細胞におけるCB2およびTRPV1の共局在を示す(白抜きの矢印)。CB 2のみで陽性標識された大口径DRGニューロンの例も示されている(矢印)。スケールバー = 100 μm。滑膜において、CB2(緑色:D)およびTRPV1(赤色:E)抗体染色が明らかである。併合画像(F)は、滑膜細胞におけるCB2およびTRPV1抗体標識の 共局在を示す(白抜きの矢印)。スケールバー = 50 ミクロン。
偽処置動物およびMIA処置動物では、滑膜の細胞内に CB 2 抗体標識および TRPV 1 抗体標識の両方が見られた[ 図1(D)および(E)。補足図1(D)、(E)]。個々の抗体で標識された組織切片の検査とマージされた画像は、滑膜細胞がCB 2抗体とTRPV 1抗体で二重標識されている例が多数あることを示しました [ 図1(F)。補足図1(F)]。これらの研究では定量的評価は行われていないが、CB 2の発現パターンまたは発現レベルに明らかな違いはなかった。 注射後14日目の、MIAおよび偽処置膝関節由来の滑膜またはDRG中のTRPV1受容体。
神経特性
1匹の動物につき1〜3個の求心性線維を調べた結果、合計154 単位( 対照膝関節で77 単位、MIA治療膝関節で77 単位)がこの研究で記録された。これらの繊維の電気生理学的特性は表1に要約されている。対照関節における求心性神経の基礎発火率は、無害な運動の間に30.8(CI:27.5-34.0)、そして有害な運動の間に76.5(CI:71.6-81.4)であった。MIA関節における求心性神経の基礎発火率は、無害な運動の間に49.0(CI:45.7–52.2)、そして有害な運動の間に100.0(CI:95.2–104.8)であった。生理食塩水を注射した対照関節と比較して、MIA治療膝関節における求心性神経の平均発火率は、両方の関節回転中に有意に高かった(P < 0.0001対応のないスチューデントのt 検定)。試験 終了時にKCl(0.4mM、0.1ml)の局所動脈内注射によって試験した全てのユニットを活性化することができ、投与された試薬が実験を通して機械感覚神経終末に達したことを確認した。 表I。対照および変形性関節症(OA)膝関節で記録されたIII型およびIV型非髄鞘線維の割合と範囲の電気生理学的特性 MT = 機械的閾値。ET = 電気的閾値。CV = 伝導速度 M T(mNm) E T(V) CV(m / s) 繊維の% コントロールジョイント タイプIII 5〜34 6.5〜9 2.6〜7.4 39 タイプIV 7–45 5.5〜10.5 0.4〜2.4 61 OAジョイント タイプIII 3〜16 6〜10 2.9〜23.4 28年 タイプIV 3〜22 6.5〜12 0.6〜2.4 72 コントロール膝関節におけるGW405833の効果 対照膝関節の回転により、GW405833の注射は、機械感覚神経活動の有意な抑制を誘導した。求心性発火率に対するGW405833の抑制効果を示す標本記録を図2(A)に示す。ビヒクルの適用は機械的感受性に有意な影響を及ぼさなかった。GW405833の減感効果は、10用量範囲にわたって用量依存的であることが判明した-12 -10 -8 モル、[ P < 0.0001。一方向ANOVA ; 図2(B)]。GW405833のEmaxは、−26.5%(CI:−33.3〜 − 19.7)であった。ビヒクルと比較して、GW405833の減感作用は統計的に有意であった[ 二元配置分散分析;P<0.0001。図2(B)。n = 22–27]。 高解像度画像をダウンロード(151KB)フルサイズの画像をダウンロード 図2。対照膝関節に対するGW405833の効果 (A)GW405833の動脈内適用前後の対照膝関節の回転中の単一ユニットの標本記録。GW405833 は関節求心性神経線維の発火率を有意に減少させました。(B)食塩水を注射した膝関節の回転に応答した膝関節求心性神経の機械的感受性に対するGW405833の効果。GW405833の減感作効果は用量依存的で、ビヒクルコントロール治療の効果とは有意に異なりました[二元配置分散分析によるP < 0.0001 (n = 22-27ファイバー))。値は、95%CIを有する全ての時点の平均である。 MIA膝関節におけるGW405833の効果 MIA関節において、GW405833は記録された繊維の有意な増感を引き起こしたが、ビヒクルの適用は関節の機械的感受性に有意な影響を及ぼさなかった。MIA関節における求心性神経活動に対するGW405833の興奮作用を示す標本記録を図3(A)に示す。GW405833の増感効果は、用量範囲にわたって用量依存的であることが判明した10 -12 -10 -8 モル[ P < 0.0001。一元配置分散分析; 図3(B)] E max = 34.9%(CI:24.7-45.1)。ビヒクルと比較して、この感作効果は統計的に有意であった(二元配置分散分析、P < 0.0001; n = 24–28)。 高解像度画像をダウンロードする(127KB)フルサイズの画像をダウンロード 図3。変形性関節症(OA)関節に対するGW405833の効果 (A)GW405833の密接な動脈内適用前後のOA膝関節の回転中の単一ユニットの標本記録。GW405833 は関節求心性神経線維の発火率を有意に増感した。(B)OA膝関節の回転に応答した膝関節求心性神経の機械的感受性に対するGW405833の効果。GW405833の感作効果は用量依存的であり、ビヒクルコントロール治療の効果とは有意に異なった[二元配置分散分析によるP < 0.0001 (n = 0)。 24-28繊維)。値は、95%CIを有する全ての時点の平均である。 タイプIIIおよびタイプIV繊維の応答特性 記録された繊維のサブグループにおいて、タイプIII対IV求心性神経の応答特性が比較された。機械的閾値、電圧閾値またはベースライン発射頻度に差は見られなかった。しかしながら、コントロール動物におけるGW405833の阻害効果は、タイプIV繊維の阻害効果が比較的小さいので主にタイプIII繊維の活性化によって仲介された(対応のないスチューデントt検定;P = 0.005;表II)。III型線維はGW405833によって感作されなかったので、MIA動物におけるGW405833の侵害受容促進効果は、IV型線維の活性化によって媒介された(対応のないスチューデントt検定;P = 0.007;表II)。 表II。GW405833適用後のタイプIIIおよびタイプIVファイバの応答特性 対照関節において、GW405833の減感作用は、IV型繊維と比較してIII型繊維において有意に高かった。MIA関節では、感作効果はIV型繊維を介して媒介された。III型とIV型繊維の違いは、対応のないスチューデントt検定を用いて評価した。[データは95%信頼区間の平均値(下限値、上限値)] 発射率の変化率 N P値 コントロールジョイント タイプIII −61.6(−79.9、−43.3) 30 タイプIV −29.5(−42.61、−16.37) 67 (0.005) MIAジョイント タイプIII 2.3(−8.4、13.1) 40 タイプIV 27.4(9.0、45.4) 85 (0.007) 対照膝関節におけるGW405833反応に対する選択的CB 2受容体拮抗作用の効果 選択的CB2受容体拮抗薬 AM630の同時投与は、最高用量のGW405833の減感作効果を低下させた[ボンフェローニの多重比較検定による一元配置分散分析;P < 0.0001。n = 20。図4(A)]。単独で与えられたAM630は、対照膝における求心性発火頻度に有意な影響を及ぼさなかった。 高解像度画像をダウンロードする(178KB)フルサイズの画像をダウンロード 図4。(A)対照(食塩水注射)膝関節に対するCB2受容体アンタゴニスト AM630とGW405833(10-8 mol)との同時投与の効果。CB2拮抗薬AM630は、GW405833の減感作用を有意に減少させた。一方向ANOVAボンフェローニの多重比較検定で。(B)OA関節において、GW405833は、ビヒクルと比較して有意な感作を引き起こす。このGW405833媒介感作はAM630の同時投与またはTRPV1 受容体拮抗薬の予備投与によって阻止された SB366791; ボンフェローニの多重比較検定による一元配置分散分析。単独で投与した場合、AM630またはSB366791は関節の機械的感受性に有意な影響を及ぼさなかった。値は、12〜28本のファイバーの95%CIを持つすべての時点の平均です。 MIA膝関節におけるGW405833反応に対する選択的CB 2およびTRPV 1受容体拮抗作用の効果 CB2受容体拮抗薬AM630は、GW405833の感作効果を有意に遮断した[P<0.0001;M。ボンフェローニの多重比較検定による一元配置分散分析。n=17。図5(B)]。GW405833の前にTRPV1受容体拮抗薬SB366791を予備投与すると、関節回転中のカンナビノイドの感作効果も抑制された[P<0.0001;P.ボンフェローニの多重比較検定による一元配置分散分析。n=26。図4(B)]。単独で与えられたAM630とSB366791はMIA膝の求心性発火頻度に有意な影響を及ぼさなかった。 高解像度画像をダウンロードする(157KB)フルサイズの画像をダウンロード 図5。ビヒクル注射と比較した、対照関節およびOA関節における後肢重量分布に対するGW405833(10-6 mol)の関節内注射の効果。対照関節において、GW405833は、ナイーブラットと比較して体重分布に有意な影響を及ぼさなかった。GA405833注射後のOAラットでは、体重は注射されていない反対側の後肢に再分配されたが、CB2受容体アンタゴニストAM630の同時投与またはTRPV1受容体アンタゴニストSB366791の予備投与はこのGW405833誘発体重減少を軽減した。GW405833の鎮痛効果は最大60であった 注射から数分後。ボンフェローニの多重比較検定。n = 8動物/群。データは95%CIの平均値です。 対照およびMIA膝関節における後肢重量分布に対するGW405833の効果 OAの誘導は、ナイーブラットと比較して同側後肢にかかる体重の量を有意に減少させた(P = 0.001;ボンフェローニの多重比較検定を用いた一元配置分散分析; n = 8; 図5 )。ナイーブラットは2つの後肢の間で体重を均等に分配するが、MIAラットでは同側後肢にかかる体重は約30%に減少した。GW405833の関節内注射(10 -6 MIA処置関節内への(mol)の投与は、動物の体重のわずか20%が同側後肢に配置されるように、体重分布のさらなるシフトを引き起こした。体重分布のシフトは、60 分の時点で最大レベルの無力容量に達した(P < 0.001; Bonferroniの多重比較検定を用いた一元配置分散分析; n = 8; 図5)。この観察は、GW405833がMIA関節において疼痛反応の増強を引き起こしたことを示している。ビヒクルの注射は体重分布に影響を及ぼさなかった。生理食塩水を注射した対照ラットの膝において、GW405833の関節内注射は、後肢重量分布に有意な影響を及ぼさなかった(P = 0.67一方向ANOVA;n =1)。 6; 図5) 後肢重量分布に対するCB 2およびTRPV 1遮断の効果 CB2拮抗薬AM630(10-8 mol)の関節内同時投与は、60 分の時点でGW405833媒介性疼痛反応を完全に遮断した(P < 0.001;ボンフェローニの多重比較検定を用いた一元配置分散分析;n = 8)。 ; 図5 )。さらに、GW405833の関節内注射の前のTRPV1チャネルアンタゴニストSB366791の腹腔内注射は、CB2アゴニストに対する疼痛応答を遮断した(P < 0.001;ボンフェローニの多重比較検定を用いた一方向ANOVA;n = 8)。AM630またはSB366791それ自体の投与は、ビヒクルと比較して、関節無力に有意な影響を及ぼさなかった。これらの行動データは電気生理学的結果と一致しており、GW405833がMIA関節において痛みを伴う反応を引き起こすこと、およびCB2受容体およびTRPV1チャネルの両方がこの効果の媒介に関与していることを確認している。 in vitroでの CGRP放出 – TRPV1受容体のリン酸化の影響 GW405833の効果を基礎(非リン酸化)および刺激(リン酸化)条件下でインビトロで評価した。TRPV1受容体がその非リン酸化状態では、GW405833は 30μMの濃度までCGRP放出に影響を及ぼさなかった(図6)。しかし、リン酸化された状態でTRPV1と、GW405833は、ECとCGRPの有意な放出を誘発50 9の μMおよびE maxの 60%(0.3の最大有効濃度に比べ μMカプサイシン)。これらのデータは、リン酸化条件下で、GW405833がTRPV1受容体においてアゴニストとして作用し得ることを示唆している。 高解像度画像をダウンロードする(80KB)フルサイズの画像をダウンロード 図6。成体ラット脊髄からのCGRP放出に対するGW405833の効果についての濃度反応曲線。GW405833は、TRPV1チャネルの 基礎(白四角)条件下で単独でアッセイしたところ、CGRP放出は観察されなかった。TRPV1チャンネル(黒三角)のリン酸化後、CGRP放出は有意に増加した(二元配置分散分析、P <0.001)。各データ点は、カプサイシンおよび緩衝液対照のパーセントとして表した95%CIを有する平均CGRP放出を表す。n=3。 討論 いくつかの研究は、機能的に活性なCBの存在確認2つの免疫細胞上の受容体、一次求心性神経、後根 神経節および脊髄の35、36、37。最近、CB 2 受容体発現はで実証されている滑膜 CBのための潜在的な役割を支持し、OA患者の2つの関節炎疼痛の治療に選択性リガンドを36、37、38。本研究において、我々はCB 2受容体がラットの膝関節に存在すること、およびCBの局所的適用を発見した。2受容体アゴニストGW405833は、非関節炎膝関節における侵害受容反応を阻害した。しかしながら、MIA関節において、GW405833はもはや抗侵害受容性ではなかったが、驚くべきことに関節の機械感受性神経線維の感作をもたらした。これらの電気生理学的所見は、OAの誘発後にGW405833の鎮痛効果を示す関節痛の行動試験において確証されたが、対照動物では薬物は体重負荷に影響を及ぼさなかった。GW405833が対照関節では抗侵害受容性であるがMIA膝では侵害受容性ではないという逆説的な発見は、この特定のカンナビノイドの調節的役割が疼痛伝達においては、臓器の病態生理学的状態によって左右される。CB 2受容体アゴニストJWH133が正常な膝関節に局所的に適用された場合に滑膜血流の増加をもたらしたが、炎症を起こした膝関節の血管運動の有意な変化を引き出すことができなかった39。GW405833の発痛効果が示す他の研究とは対照的であり、ここで強調表示された鎮痛効果急性炎症性疼痛のモデルにおけるGW405833の16、21、40、41、42。ただし、前述の研究では、GW405833は非常に高用量で全身投与されているため、脊髄または脊髄上の作用部位を持つ可能性があります43。 CB2アゴニストの報告された抗侵害受容効果の原因となるメカニズムは未だ知られていない。本研究では、GW405833が免疫細胞上のCB2受容体を活性化することによって正常関節における機械感受性を阻害し、それによって制御条件下では無視できる量の循環炎症細胞が存在するので炎症誘発性メディエーターの放出を減少させることはありそうにない。ここで報告されているGW405833の抗侵害受容効果は、メカノトランスダクションの直接的阻害を表す可能性が高い関節の一次求心性神経線維 この現象に対する異なる機械感受性神経線維サブタイプの相対的な寄与のより詳細な分析は、タイプIIIおよびタイプIV求心性神経がGW405833に対して示差的応答を生じたことを明らかにした。制御関節において観察された減少mechanosensitivityは主に媒介された介して MIAの関節におけるGW405833のプロ侵害受容効果は、IV型求心性によって主に媒介されたのに対し、薄く有髄III型求心性神経を。興味深いことに、これらの電気生理学的知見は、CBことを示した我々の組織学的データに対応する 2つの CBに対し、大および中型ニューロン(III型繊維)上の受容体は、単独で起こる 2つの小型ニューロン(IV型繊維)上の受容体は、多くの場合と共局在します侵害受容性TRPV1 チャンネル ミエリン化されていないIV型線維は小径の体細胞から生じ、ミエリン化されたIII型線維は中径および大径の体細胞から生じる44 ことが示されている。この知見は、ヒト感覚ニューロンの亜集団におけるTRPV1およびCB2受容体の共局在を示す以前の研究と類似している25。したがって、MIA関節では、GW405833はIV型関節求心路のTRPV1チャネルと相互作用することによって関節痛を促進する可能性があります。実際、この研究において、TRPV1アンタゴニストSB366791を用いたMIA関節の前処置は、GW405833の侵害受容促進作用および痛覚過敏作用を遮断した。他の所での証拠は、CB 2受容体活性化がTRPV 1感受性を調節できることを見出した25そのTRPV1チャネルは CBの機能的活性に必須である2滑膜血流調節における受容体作動薬 39。 GW405833は、制御関節のmechanosensitivityを減少したが、MIAの関節に投与された場合、侵害受容性応答を増大TRPV1チャネルは、そのリン酸化(増感)または脱リン酸化(脱感作)の状態で存在するかどうかに関連し得る理由として、追加の説明45、46。in vitro アッセイ、我々はGW405833はプロ侵害受容のリリース引き起こしことがわかった神経ペプチド脊髄ニューロンからのCGRPをしかし、ニューロンTRPV1受容体がリン酸化された状態にあった場合のみです。したがって、GW405833は、リン酸化TRPV1受容体において弱い部分アゴニストとして作用して、関節侵害受容器をさらに感作するCGRPの二次放出をもたらす可能性がある。痛みを引き起こします。炎症誘発性リン酸化 TRPV1の 47、 48 だけでなく、アップレギュレーションチャネルの49は、 MIAの膝でGW405833のプロ侵害受容、TRPV1媒介行為はその取って代わるようにMIA動物におけるTRPV1への結合GW405833の確率を高めることができ正常な関節に見られるような抗侵害受容性CB2受容体媒介効果。 結論 この研究において、CB2受容体アゴニストGW405833の局所投与は、一次求心性神経活動を低下させることによって正常関節における関節侵害受容伝達を有意に抑制したことが見出された。逆にMIA関節では、GW405833はIV型関節求心性神経上の感作TRPV1受容体に結合してCGRPの二次放出を導き、これはさらに痛覚過敏を引き起こす関節求心性神経を感作する。この過程が他のCB2受容体アゴニストにも当てはまるかどうかは、さらなる調査が必要である。 投稿者の投稿 実験計画法と知的入力:NS、JJMcD、MPJ、AJM、ESN。 データ収集と分析:NS、CZ、JJMcD、AJM、LMB、DLH。 データの解釈と原稿の執筆:NS、JJMcD、AJM、MPJ、ESN。 利益相反 作者は利益相反を宣言しません。 謝辞 Chantelle Reidの技術支援に感謝します。この作品は、カナダのArthritis Network(CAN)およびEli Lilly&Co、USA からのIndustry Partnership Program助成金によって支援されました。JJMcDは、アルバータ遺産医学研究財団(AHFMR)上級学者賞およびカナダ関節炎協会研究員賞を受賞しています。NSは、CANおよびAHFMRから博士研究員奨学金を受けました。 付録。補足データ 高解像度画像をダウンロードする(245KB)フルサイズの画像をダウンロード 補足図1:MIA処理ラットDRG細胞(A〜C)および滑膜( D〜F)におけるCB 2 抗体とTRPV1抗体の共局在。CB2(緑色:A)およびTRPV1(赤色:B)抗体染色は、腰部DRG細胞において明らかである。CB2染色は、小、中および大径のDGR細胞において明らかであり、一方TRPV1発現は、主に小および中サイズの細胞において見られる。併合画像(C)は、中小サイズの細胞におけるCB2およびTRPV1の共局在を示す(白抜きの矢印)。CB 2のみで陽性標識された大口径DRGニューロンの例も示されている(矢印)。スケールバー = 100 μmで。滑膜では、CB2(緑色:D)およびTRPV1(赤色:E)抗体染色が明らかである。併合画像(F)は、滑膜細胞におけるCB2およびTRPV1抗体標識の 共局在を示す(白抜きの矢印)。スケールバー = 50 ミクロン。 参考文献 1 SE Bove 、SL Calcaterra 、RM Brooker 、CM Huber 、RE Guzman 、PL ジュノーなど。 ヨード酢酸モノナトリウム誘発性変形性関節症のモデルにおける疾患進行の尺度としての体重負荷および抗炎症化合物の有効性 変形性関節症軟骨、11 (2003 )、821 – 830ページ 記事のダウンロードPDFを見るScopus Google Scholar 2 R. クーム、S. ブラムウェル、MJ フィールド 変形性関節症のヨード酢酸一ナトリウムモデル:ラットにおける慢性侵害受容性疼痛のモデル? 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