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概要
目的
腰椎椎間関節変性症(FJD)は腰痛(LBP)と坐骨神経痛の重要な原因である可能性があります。この研究の目的は、ヒト変性椎間関節嚢(FJC)組織における炎症性因子発現および血管新生の細胞内変化を特徴付けることであった。疼痛刺激におけるFJC組織のこれらの変化もまた評価した。
設計
FJは、脊椎再建術を 受けた罹患患者および腰痛の既往歴のない死体ドナーから得られた。FJの組織学的分析を行った。サイトカイン抗体アレイおよび定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)を用いて炎症性サイトカインの産生を決定し、ウエスタンブロッティング分析(WB)を用いて軟骨分解酵素および疼痛メディエーターをアッセイした。ヒトFJC組織とのエクスビボラット後根神経節(DRG)共培養も行った。
結果
症状のある被験者から外科的に得られた変性FJCでは、血管新生の増加、炎症細胞の浸潤、および疼痛関連軸索促進因子が観察された。増加したVEGF、(NGF / TrkA)、および感覚ニューロン分布もまた、LBPを有する被験体由来の変性FJC組織において検出された。qPCRおよびWBの結果は、変性FJCにおいて高度にアップレギュレートされた炎症性サイトカイン、疼痛メディエーター、および軟骨分解酵素を実証した。DRGおよびFJC組織のエクスビボ共培養の結果は、変性FJC が感覚ニューロンにおける炎症性疼痛分子の発現を増加させることを実証した。
結論
変性FJCは非常に増加した炎症性および血管形成性の特徴を有し、これらの因子がFJDの進行において重要な役割を果たし、そして関節変性と求心性疼痛線維の神経刺激との間の関連として役立つことを示唆している。
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キーワード
ヒト椎間関節莢膜組織腰痛炎症性サイトカイン血管新生神経内殖炎症性疼痛メディエータ
前書き
腰痛はアメリカの成人を苦しめている最も一般的な病状の一つです。生涯有病率は10〜20%が経験して、およそ70から85パーセントである慢性腰痛(LBP)1。椎間関節の変性 LBPのソースとして(FJD)は、しばしば「椎間関節症候群」と呼ばれます。変形性関節症、慢性腰痛の患者のうち、15から45パーセントの入射とLBPの一般的な原因である変化から生じるFJD 2、 3、 4、 5、 6は、広範囲の最近の記事に概説されている 7、 8。
椎間関節(FJ)は、2つの連続した椎骨の間の対になった接合体関節です。対を成すFJとそれに対応する椎間板は、「脊椎運動分節」7を構成する「3関節複合体」を構成します7。FJは、脊椎運動分節において圧縮荷重、剪断荷重、および軸方向荷重を受ける。FJDは、椎間板変性に関連することができる9、10、11、12 。FJは硝子軟骨、半月板、滑膜、および関節包からなる。FJを通して背側一次ラムスコースの内側枝と感覚神経支配を分配する。関節の周囲の滑膜で裏打ち線維性結合組織のように定義されたヒト椎間関節嚢(FJC)組織は、豊かな侵害受容性と神経支配された神経線維、自律神経繊維及びメカノ13、14、15。さらに、FJは後根 神経節(DRG)16のすぐ近くにあります。
サイトカインメディエーター炎症の血管新生、感覚ニューロンの内部成長及び痛みは関節の変性の参加者として関与している17、 18、 19、 20。関節組織の炎症、血管新生、感覚ニューロンの内部成長及び疼痛に関連するサイトカインの産生と関連している病理ローディング、 21、 22、 23、FJDに関連付けられている 24、 25 。LBPは小面肥大に起因する可能性があることが研究により示されています、炎症、または悪化。しかし、FJC組織とLBPとの間の正確な関係は完全には理解されていない26、27、28、29。
前の研究は、サイトカイン放出変性FJSからの解放とレベルは、患者のLBP症状に比例していること30、31 。膝などの他の関節は、変性と関連して血管新生を示すことが示されている。血管新生と関連した神経成長は、関節の変性および疼痛にリンクされている 17、18、19、20。FJDに寄与するその根本的なメカニズムはさらなる研究を必要とします。FJDが疼痛形成に進行するメカニズムは不明のままであり、継続的な調査の対象となっています。
本研究の目的は、変性FJを伴う慢性LBP患者から得られたFJC組織に生じる炎症、血管新生、ニューロンの内方成長および疼痛メディエーターを調査することである。さらに、末梢組織と感覚ニューロンとの間の機能的メカニズムおよび潜在的な細胞コミュニケーションを研究するために、変性FJC組織およびラット腰椎DRGを使用するエクスビボ器官共培養システムが開発された。
方法
人間の脊椎組織の取得
ドナー組織:同意された無症候性の器官ドナー組織サンプルを、死後24時間以内にGift of Hope Tissue Network(イリノイ州エルムハースト)から入手した。希望の組織ネットワークの贈り物は、病院のカルテからの臓器提供者についての臨床情報と近親者からの個人的な歴史を提供しました。臨床的腰痛症状が報告されていないドナーからの腰椎切片を我々の実験用に採取した。各腰椎切片を磁気共鳴画像法(MRI)によって検査した。無傷のFJを取り出し、無菌的に処理した。FJC組織を採取して軟骨Collins et al。によって開発されたスケールに従って、グレード0(正常)、1 – 2(早期変性)から3 – 4(進行性変性)までの変性について視覚的に等級付けされた。FJD 10のための確立された MRIの等級分けシステムと併せて 32。
手術用組織:治験審査委員会(IRB)の承認および患者の同意を得た後、無傷のFJが、日常的な脊椎固定術を受けているLBP患者から除去され、整形外科用組織保管庫によって提供された。次いで、FJを上記のように等級付けした。組織源および詳細な組織情報は表Iに列挙されている。
表I。集められた小面関節の人口統計
サンプルの種類 年齢 性別 症状 FJグレード
臨床サンプル(外科的に採取) 77Y F 骨粗鬆症、退行性小面症、重度の腰痛を伴う脊椎狭窄 G4
82Y M 重度の脊椎狭窄、重度の腰痛を伴う変性面 G4
47歳 M 重度の腰痛を伴う外側陥凹狭窄 G4
67歳 F 重度の腰痛を伴う変性側弯症および脊椎すべり症 G4
78Y M 脊椎すべり症、脊柱管狭窄症、変性面、重度の腰痛 G4
30歳 M 変性椎間板疾患と腰痛 G3
39歳 M 重度の腰痛、外傷性腰痛による椎間板変性 G3
80Y F 腰痛を伴う変性性脊椎症、変性性面 G4
63Y F 脊椎すべり症、脊柱管狭窄症、変性面、腰痛 G4
31Y M 重度の腰痛 G3
57歳 F 変性腰椎側弯症 G3
77Y F 脊椎すべり症、高度に変性した椎間関節 G3
75歳 F 両側性の脚と背中の痛みを伴う脊椎狭窄 G4
62Y M 変性側弯症、L3 / L4脊椎すべり症、L3 / L4腰椎狭窄、腰痛 G4
70Y F 重度の腰痛、重度の椎間関節変性 G4
56歳 M 重度の椎間関節変性、腰痛 G3
74年 F 重度の椎間関節変性、腰痛 G3
死体 61Y M 下にある骨、両側L3 / 4小面を露出する軟骨の喪失 G4
ディープゾーンへの表面割れ目、左L4 / 5ファセット G3
21Y F 無傷のサーフェス、両側L3 / 4ファセット G0
無傷の表面、両側L4 / 5ファセット G0
48歳 F 表面亀裂、両側L3 / 4ファセット G1
表面亀裂、両側L4 / 5ファセット G1
48歳 M ディープゾーンへの表面割れ目、左L4 / 5ファセット G3
ミッドゾーンの表面亀裂両側L4 / 5小面 G2
50歳 M ミッドゾーンへの表面割れ目、右L4 / 5ファセット G2
56歳 M 深層への表面割れ目、左L3 / 4ファセット G3
完全破壊、二国間L4 / 5ファセット G4
44歳 F ミッドゾーンの表面亀裂両側L3 / 4ファセット G2
ミッドゾーンの表面亀裂両側L4 / 5小面 G2
28歳 F 無傷の表面、両側ファセットL3 / 4 G0
表面割れ目、両側L4 / 5事実 G1
33歳 M 表面亀裂、両側L3 / 4ファセット G1
表面亀裂、両側L4 / 5ファセット G2
53歳 F 深層への表面割れ目、左L3 / 4ファセット G3
ミッドゾーンへの表面割れ目、左L4 / 5切子面 G2
65歳 M 完全破壊、二国間L4 / 5ファセット G4
グレーディング n数 年齢 性別 組織の種類
男性 女性 臨床 死体
G:0 3 23.3±4 0 3 0 3
G:1 6 36±9 3 3 0 4
G:2 6 45±7 3 3 0 6
G:3 7 53±7 4 3 5 4
G:4 15年 69±10 7 8 12年 3
合計 37 53±17 17年 20 17年 20
ウエスタンブロッティング(WB)
製造者によって提供された説明書に従って、細胞溶解緩衝液(Cell Signaling、Danvers、MA、USA)を使用して、ヒトFJC組織からの総タンパク質を抽出した。ヒトFJC組織のタンパク質濃度は、ビシンコニン酸タンパク質アッセイ(Pierce、Rockford、IL、USA)によって決定した。等量のタンパク質(30μgタンパク質/ウェル)を10%SDS - PAGEにより分離し、次いでウエスタンブロット分析のためにニトロセルロース膜上にエレクトロブロットした。免疫反応性は、ECLシステム(Amersham Biosciences、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ)を用いて視覚化した。
逆転写(RT)およびリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応
製造業者によって提供された説明書に従って、 Trizol 試薬(Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)を用いて全RNAを単離した。第一鎖cDNA合成のためにThermoScript(商標)RT − PCRシステム(Invitrogen)を使用して、1μgの全RNAでRTを実施した。リアルタイムPCRのために、MyiQリアルタイムPCR検出システム(Bio-Rad Hercules、CA、USA)を用いてcDNAを増幅した。製造業者(Bio-Rad)により提供されるiQ 5 Optical System Softwareを用いて各増幅曲線から閾値サイクル(Ct値)を得た。製造業者(Bio-Rad)により詳述されているように、相対的なmRNA発現をΔΔCT法を用いて決定した。プライマー配列およびそれらの条件は要求に応じて提供されるであろう。
サイトカイン抗体アレイと定量
サイトカインタンパク質のアレイ(Cytokine Array、RayBio、Norcross、GA、USA)を用いてサイトカインレベルの変化を決定した。マイクロアレイアッセイについては、製造業者によって提供された指示に正確に従った。簡単に説明すると、膜を2mLの1×ブロッキング緩衝液と共に室温で30分間インキュベートして膜をブロックした。ブロッキング緩衝液をデカントした後、無症候性ドナー対照(莢膜肥大の徴候のないFJグレード0または1)から抽出した500μgの全タンパク質または症候性LBPを有する対象からの外科用FJC組織と共に、膜を4℃で一晩インキュベートした。ビオチン結合抗体による。デカントした後、全ての膜を2mLの1×洗浄緩衝液Iで室温で5分間3回洗浄し、続いて1×洗浄緩衝液IIでさらに2回室温で洗浄した。その後、全ての膜をビオチン結合抗体の希釈物(1:250)と共に室温で2時間インキュベートし、そして洗浄工程を繰り返した。免疫反応性を可視化し測定するために、これらの膜をさらにインキュベートした。セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合ストレプトアビジン。ECLシステム(Amersham Biosciences、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ)およびSignal Visual Enhancerシステム(Pierce)を用いて免疫反応性を視覚化し、シグナル強度を拡大した。濃度測定測定は、Molecular Imager Versadoc MP 4000システム(Bio-Rad)およびQuantity One-4.5.0 Basic 1-D分析ソフトウェア(Bio-Rad)を使用して各スポットの積分密度値(面積相対強度)を計算することによって行った。各膜の陽性対照シグナルを用いてシグナル強度を標準化した。
組織学的/免疫組織学的評価
ヒト腰椎FJを4%パラホルムアルデヒド中で72時間固定し、22%ギ酸および10%クエン酸溶液中で脱灰し、骨組織が柔らかくなるまで4日ごとに交換した。脱灰したFJ組織を横断面で切断し、パラフィン包埋した。正確に厚さ5μmの連続FJ切片を切断してスライドを調製した。サフラニン−Oファストグリーン染色を用いて、軟骨粉砕物質中の一般的な形態およびプロテオグリカンの損失を評価した。アルシアンブルーヘマトキシリン/オレンジG染色を用いて、一般的な形態学および構造変化を評価した。以下の一次抗体を免疫組織化学的(IHC)染色に使用した:抗血管内皮増殖因子(VEGF)(ab39250; Abcam、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国)。α−平滑筋アクチン(α− SMA)(ab5694、Abcam)。CD11b(サンタクルスバイオテクノロジー、ダラス、テキサス州、米国)。ニューロフィラメント−M(NF − M)(Thermo Scientific、Waltham、MA、USA)。そして神経成長因子(NGF)/トロポミオシン受容体キナーゼA(TrkAの)(Abcam社)。標準アビジン – ビオチン – ペルオキシダーゼ複合体技術を用いてIHCを実施した。次に、Vectastainキット(Vector Laboratories、カリフォルニア州バーリンゲーム)を用いて切片を視覚化し、続いてで染色した。ヘマトキシリン。免疫蛍光染色のために、蛍光標識二次抗体を添加し、スライドを暗所にて室温で1時間インキュベートした。切片をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中ですすぎ、退色防止封入剤(Vector Laboratories)中に載せ、そしてOlympus BX43直立顕微鏡(Olympus Optical、米国ペンシルベニア州センターバレー)を用いて調べた。
DRGコカルチャー
疼痛症状のない成体Sprague-Dawleyラット(250〜300 g)を二酸化炭素で安楽死させた。L1からL5までの両側腰椎DRG(ラットあたり10個のDRG)を、立体顕微鏡下で無菌解剖により慎重に除去し、特に物理的損傷を避けるように注意した。無作為に選択した3つのラットDRGを個々のウェルに入れ、1%mini-ITS、1%GlutaMAX、および1%HEPESを含むDMEM培地中で5日間、正常または変性FJC組織または培地対照と共に共培養した。各実験群は、培地対照を有する3つのウェル、または各ウェル中の独特の正常もしくは変性FJC組織を含んだ。各ウェル中の3つのDRGを、以前に記載されたように33、RNA抽出およびPCRのために回収した。
統計分析
SPSS Windows(バージョン12.0、IBM Corporation、ニューヨーク州サマーズ)およびSAS(バージョン9.2、SAS Institute、ノースカロライナ州ケアリー)を用いて記述統計量を計算し、群の相違を試験しそして多重試験によるエラーインフレを補正した。ほぼ正規分布と同様の分散を持つ変数については、両側t検定を使用してグループを比較しました。多重仮説検定によるエラーインフレーションの問題を調整するために、Benjamini and Hochberg(1995)34に記載されているように、誤発見率(FDR)を制御する調整方法を使用しました。Pの分析部によりグループ化された-値は、従ってエラー膨張の問題を最小限に抑える、FDRを制御するようにしてリニアステップアップ調整を使用して調整しました。A P 誤差インフレの調整後、≦0.05の有意水準をすべての統計的検定に使用した。図中に示されている個々のP値。データは平均として表した。エラーバーは95%信頼区間(CI)として表した。
結果
ヒトFJDの肉眼的および組織学的外観
ヒトFJSの総出現を調べ、下関節面の外観(コリンのグレード:G0-G4;のための代表的なグレードを割り当てた。図1のA及びB)32、35 。より高い等級を有する試料は、端部骨棘、反応性骨、および軟骨の発熱のサイズの増加を示した。症状のある外科用サンプルは明らかに最も退行性の高い形態学的変化を示した(表I)。ヒトFJの肉眼的外観を、正常グレード(G0)と異なるグレードの病理学的状態を有する変性面とを比較することによるプロテオグリカン含有量についての組織学的検査によってさらに分析した(G2〜4)。サフラニン O染色は重症を示した正常な関節(G0)と比較して進行した変性(G3 / 4)を有するFJにおけるプロテオグリカンの枯渇(図1C)。FJのアルシアンブルーヘマトキシリン/オレンジGおよびH&E染色の結果は、グレードと相関する構造的および形態的変化の観察をさらに支持した(図1DおよびE)。
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図1。通常および変性FJSのグロスと組織学的出演。A、ヒト腰椎FJの解剖学的構造および腰椎FJにおける下関節突起の作製。B、FJおよびFJC組織の全体的な外観。各FJは、下位ファセットの外観に対して代表的な等級を割り当てられています。より高いグレードのFJサンプルは、エッジ骨棘、反応性骨、および軟骨の焼灼のサイズの増加を示しています。C、サフラニンO、D、アルシアンブルーヘマトキシリン/オレンジG、およびFJ軟骨のE、ヘマトキシリンおよびエオシン染色は、プロテオグリカンの激しい枯渇を示す。正常FJ(G0)と比較した、変性FJ(G4)の、線維化、構造的および形態学的変化。結果は 、G 0については少なくともn = 3、各等級についてはn= 6のドナー数、G 2〜4を表す。
変性FJC組織では炎症が増加する
免疫細胞浸潤のマーカーであるCD11bについての染色の結果は、変性FJC組織における炎症性細胞の浸潤を示した(図2A)。我々は、正常FJC組織(G0)と比較して、変性FJC組織(G3 / 4)におけるサイトカインの発現を調べた。サイトカイン抗体アレイ分析の結果は、GROα、sICAM - 1、INF -γ、IL - 1β、IL - 17、RANTESおよびTNFα を含む複数の炎症誘発性サイトカインのレベルの有意な増加を明らかにした(P <0.01)。 1α、IL-17E( P <0.05)、ならびに抗炎症性サイトカインIL-10のレベルの上昇IL-13(P <0.05)(図3A)。 高解像度画像をダウンロードする(2MB)フルサイズの画像をダウンロード 図2。正常および変性FJC組織における炎症、血管新生、およびニューロンの内方成長の評価。A、CD11bの免疫組織化学的(IHC)染色は、正常FJC組織(G0)と比較して、変性FJC組織(G3 / 4)における炎症細胞の浸潤の増加を示す。B、平滑筋アクチン(a − SMA)のIHC染色は、正常FJC組織(G0)と比較して、変性FJC(G3 / 4)組織において著しく増加した血管新生事象を示す。C、VEGFのIHC染色(上のパネル)およびWB分析(下のパネル)は、NFJC組織(G0)と比較して、変性FJC組織(G3 / 4)におけるVEGFの誘導の増加を示す。DF、IHCの結果は、実質的に増加した神経フィラメント-M(NF - M;神経突起のマーカー)を実証する。正常なFJC組織(G0)と比較した、変性FJC(G3 / 4)における神経成長促進因子、NGF、およびその同族受容体TrkA。これらの結果は、 正常FJC組織については少なくとも n= 3 、変性FJC組織についてはn= 6を表す(G1〜4)。 高解像度画像をダウンロード(792KB)フルサイズの画像をダウンロード 図3。正常及び変性椎間関節嚢(FJC)組織におけるサイトカインプロファイリング。A、正常(G0)および変性FJ組織(G3 / 4)由来のFJC組織溶解物を使用する、サイトカイン抗体アレイのデンシトメトリー分析。ヒストグラムは 、正常FJC組織(n = 3)と比較した変性FJC組織(n= 10)における変化したサイトカインのレベルを示す。B、正常FJC組織(G0)(NFJC、n = 3)と変性FJC組織(DFJC、G3 / 4)との間の炎症誘発性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインおよびTLRの比較遺伝子発現プロファイルについての定量的リアルタイムPCR分析(n = 10)。個人P図に示されている値。データは平均として表した。エラーバーは95%CIとして表した。 サイトカイン抗体アレイデータを裏付けるために、定量的リアルタイムPCR (qPCR)分析を採用した。結果は、誘導されたタンパク質レベルが炎症誘発性サイトカインのmRNAレベルの増加と相関することを証明した(図3B)。我々の個々のqPCRデータは、サイトカイン抗体アレイによって評価されたmRNAとタンパク質レベルとの間のわずかな相違を明らかにした。例えば、我々はタンパク質レベルでIL-8、CCL2、およびIL-1Raの有意なアップレギュレーションを観察しなかったが、RNAレベルは変性FJC組織において有意に増加した(P <0.05)(図3)。B)。qPCR分析はまた、IL − 18およびIL − 11、ならびに Toll様受容体TLR2およびTLR4を含むサイトカインアッセイ系では分析されなかったさらなる炎症誘発性および抗炎症性サイトカインの有意な上方制御を見出した(P <0.05)。 3 B)。 血管新生は変性FJC組織で増加する α-SMAに対する免疫反応性によって評価されるように、顕著に増加した新血管新生が変性FJC組織において明らかであった(図2B)。正常な(G0)または早期のFJ変性(G1)を進行した変性FJC組織(G3 / 4)と比較すると、血管新生は明らかに増加した。これらの血管新生事象は、免疫組織化学(図2C;上部パネル)およびウエスタンブロット分析(図2C;下部パネル)によって評価された、VEGF発現の増加と相関していた。 神経発生は変性したFJC組織で増加する 正常組織(G0)または初期段階の変性組織(G1)と比較した進行期のFJC組織(G3 / 4)では、ニューロフィラメントM (NF-M、神経突起形成のマーカー)が大幅に増加したことが示された。(図2D)。それに対応して、我々の結果は、IGF(図2EおよびF)ならびにNGFおよびTrkAのmRNAレベルについてのqPCR分析によって評価されるように、NGF / TrkA軸がFJC組織の進行性変性段階において高度にアップレギュレートされることを示した。P <0.01)(図5C)。 高解像度画像をダウンロード(710KB)フルサイズの画像をダウンロード 図4。発現は、軟骨の酵素と分解しTIMPの正常なおよび変性FJC組織では。定量的リアルタイムPCR によってmRNAレベルを評価したMMP、ADAMTS、およびTIMPの比較(AC、 n = 3正常(NFJC、G0)、n = 12変性FJC(DFJC、G3 / 4)組織)(A〜C)タンパク質に対するWB(n = 3 NFJC; n = 3 DFJC)(A’-C ‘)。図中に示されている個々のP値。データは平均として表した。エラーバーは95%CIとして表した。 高解像度画像をダウンロード(722KB)フルサイズの画像をダウンロード 図5。正常および変性FJC組織における炎症性疼痛伝達物質および疼痛神経調節物質のレベル 。A、COX-2、iNOSの比較。B、プロスタグランジン(EP)受容体。およびC、定量的リアルタイムPCRによって評価された、正常FJC組織(G0、NFJC)と比較した、変性FJC組織(G3 / 4、DFJC)における疼痛神経調節剤(CGRP、サブスタンスP、TRPV1、NGF、TrKA)の発現。以下のためのmRNA( N = 3、NFJC; N = 10 DFJC組織)とタンパク質のWB(N = 3 NFJC組織を、n個 = 3DFJC組織)。D、単離したラットDRGを培地対照(M)、NFJC組織、またはDFJC組織と5日間共培養した。総相対的遺伝子誘導の評価は、DRG中のサブスタンスPおよびNGFの定量的リアルタイムPCR分析によって評価した。データは 三重にした3回の独立した実験(n= 3ドナー)を表す。図中に示されている個々のP値。データは平均として表した。エラーバーは95%CIとして表した。 変性FJC組織は軟骨分解酵素およびメタロプロテイナーゼの組織阻害剤(TIMP)を過剰発現する 我々は、正常なものと変性FJC組織とを比較することによって、MMP- 13 、MMP-1 、MMP-3、ADAMTS-4およびADAMTS-5などの重要な軟骨分解マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)およびアグレカナーゼのレベルを調べた。コラゲナーゼ(MMP - 1、MMP - 13)およびストロメリシン(MMP - 3)は、mRNA(図4A、P <0.01)およびタンパク質レベルの両方において、変性FJC組織において高度に上方制御された[図4A ‘]。同様に、重要なアグレカナーゼ、ADAMTS - 4およびADAMTS - 5は、mRNA(図4B、P <0.05)およびタンパク質レベルの両方において有意に増加した[図4B ‘]。]。遺伝子発現の調節は軟骨分解酵素に限定されなかった。我々はまた、変性FJC組織における軟骨分解酵素活性を拮抗するファミリーメンバーであるTIMPの顕著な誘導を観察した。これらは、mRNA(図4C、P <0.05)およびタンパク質レベル(図4C ‘)でのTIMP − 2およびTIMP − 3を含んでいた。我々は、変性FJC組織においてTIMP-1の有意な増加を観察しなかった(図 4C)。 ex vivo DRG臓器共培養モデルにおける変性FJC組織は疼痛関連分子を過剰発現し、感覚ニューロンにおける疼痛メディエーターの発現に影響を与える 我々はさらに、変性FJ由来のFJC組織が疼痛関連分子を過剰発現しているかどうかを調べた。我々のリアルタイムPCRおよびWB分析は、炎症性疼痛メディエーター 誘導性一酸化窒素シンターゼ(iNOS)およびシクロオキシゲナーゼ−2(COX − 2)におけるmRNAおよびタンパク質レベルの両方における有意な増加を明らかにした(図5A、P <0.05)。プロスタグランジン受容体のサブタイプのうち、EP1、EP3およびEP4の発現レベルは、 正常(G0)と比較して、変性FJC組織(G3 / 4)において有意に(P<0.05)上昇した。予想外にも、EP2のレベルmRNA(P <0.05)およびタンパク質レベルの両方において、正常と比較して、変性FJC組織では減少した(図5B)。 サブスタンスP 、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)、NGF、TrkA、および疼痛関連イオンチャネル一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーVメンバー1(TRPV1)を含む神経調節物質の発現の有意な増加が、正常と比較して変性で見られたFJC組織(図5C;P <0.05またはP <0.01)。本発明者らのDRG共培養モデルは、サブスタンスP(P <0.05)およびNGF(P <0.01;図5D)の過剰発現によって反映される、変性FJC組織がDRGにおける疼痛メディエーターの産生を有意に変化させることを明らかにした。 討論 本発明者らの結果は、無症候性ドナーから採取したより健康なFJC組織と比較して、 LBPを有する対象からの変性FJから採取したFJC組織がより高レベルの血管新生、炎症、および神経新生を示すことを明らかにした。さらに、変性したFJC組織は、DRGニューロンが疼痛感作を増加させるように促し得る疼痛関連分子を非常に過剰発現した。 正常なFJ(G0)と比較して変性FJ(G3 / 4)に見られる炎症誘発性サイトカインおよび軟骨分解酵素のレベルの上昇は、これらの分子がFJC組織の構造的および分子的変化に役割を果たすという命題を強く支持する。隣接するFJで。それにもかかわらず、炎症誘発性サイトカインおよび軟骨分解酵素だけでなく、抗炎症性サイトカインおよび軟骨分解酵素の阻害剤、例えばIL - 10、IL - 13、TIMP - 2およびTIMP - 3もまた注意すべきである。並行して上方制御されている。同様の観察が、これは変性過程克服する修復応答の失敗した試みであり得ることを示唆し、他のヒトの関節の構造的組織で注目されている36、37、38。 最近の研究では、開発の主要な役割を果たすものとして、血管新生を示唆されている関節の変性疾患の炎症や神経支配の刺激を通って、痛みを39、40、41 。の流入が示唆されている炎症性細胞の血管新生に起因する関節への変性を悪化させ、LBPにつながる可能性が42、43 。血管新生は、それ自体は、新しい感覚の内部成長を促進神経線維を、強化痛みの知覚の原因である17、18、20 。アップレギュレーションの血管新生因子症候性患者のFJC内の炎症性サイトカイン、免疫細胞浸潤、および新たに形成された感覚神経線維の内方成長は、FJ変性の開始から疼痛発生までの進行パターンを示している可能性がある。 変性FJSに見出さ新たに形成された感覚神経線維が炎症に応答し、さらに、開始または放出を介して炎症を促進する血管作動性物質を関節内に44、45、46。FJがDRGに近接していると、これらの「クロストーク」機能が向上する可能性があります。FJの損傷は、DRG内の感覚ニューロンによる炎症性サイトカインおよび疼痛伝達物質の放出を引き起こす。その結果、これらの放出された分子は、変性FJSでnocioceptive変化に重要な配合要因となる47、48。我々のDRG共培養モデルは、重要な疼痛伝達 物質サブスタンスP およびNGFの過剰産生によって見られるように、変性FJC組織がDRG内の感覚ニューロンの機能的特性を改変することを実証している。本発明者らの結果は、炎症性神経ペプチド、受容体、およびイオンチャネル(例えば、サブスタンスP、COX-2、CGRP、EP受容体、TRPV1およびNGF / TrkA軸)の上方制御と組み合わせた、変性FJおよびDRG間の「クロストーク」を示唆する。症候性LBP患者の疼痛産生を悪化させる。 4つのTIMP ファミリーメンバー(TIMP1〜4)の中で最も強力な軟骨保護分子であるTIMP-3が、通常の膝軟骨と比較して変形性膝関節軟骨で有意に減少していることを以前に報告しました49。しかしながら、本研究において、我々は、TIMP-3が正常と比較して変性FJC組織において非常に増加した分子の1つであることを観察した。加えて、我々はまた、変性FJC組織においてプロスタグランジンE 2受容体EP 2の有意な減少を見出した。EP 2 受容体は変性膝関節軟骨において高度にアップレギュレートされており、軟骨の病態生理に関連することが知られている50。。これらの結果は、これらの分子の組織特異的な差次的発現パターンがあり得ることを示唆している。 この研究は重要な結果を生み出しましたが、考慮しなければならない制限があります。第一に、特に正常組織(G0)の場合、サンプルサイズが小さいために制限が存在する可能性があります。サンプルは同意を得た患者または死体の臓器提供者から外科的に取得されたため、大規模なサンプル母集団を取得することは困難であることがわかりました。第二に、LBPに直接起因する疼痛スコアは入手できなかったため、死体提供者から入手できる個人情報は限られていた。第三に、ヒトFJC組織とのラットDRGの使用のために、DRG共培養モデルに矛盾があり得る。他の標的を調べるためにDRG共培養システムを用いた継続的な研究は、末梢組織と感覚神経系との間の「クロストーク」の理解に有益であることを証明するはずです。 要約すると、我々のデータは、変性FJC組織における炎症性および血管新生性の特徴の増加がFJDの進行に重要な役割を果たし、そして関節変性と求心性疼痛線維の神経刺激との間の関連として役立つことを示唆する。動物モデルにおいてFJ疼痛を引き起こす症候性FJDを再現することは、ヒトの臨床研究からは答えられない翻訳または前臨床情報についての我々の理解を大いに高めるであろう。 投稿者の投稿 (1) 研究の構想と設計、またはデータの取得、あるいはデータの分析と解釈:JSキム、MHアリ、Fウィドラ、Xリー、HSアン、G Cs-Szabo、Dチェン、Sアンドリュース、JM Cavanaugh、G Xiao、JL Hamilton、M Moric、HJ Im。 (2) 重要な知的内容のために記事を起草するかそれを批判的に修正する:JSキム、Fウィドラ、JLハミルトン、Mモリック、HJイム。 (3) 提出するバージョンの最終承認:HJ Im。 資金源の役割 研究スポンサーは、研究デザイン、データの収集、分析および解釈、原稿の執筆および出版のための原稿の提出の決定に関与していませんでした。この研究は、VA BLD&Rメリットレビューアワード(HJIへ)、R01AR053220(HJIへ)、R01AR062136(へHJIへ)、およびAR05947(へGXへ)からのNIH NIAMS助成金によって支えられました。 Korea-2012R1A1A2005306(JSKへ)および中国国家自然科学基金助成金(81472049からGXへ)。 競合する利息声明 著者は、本研究の結果から利益を得ることになる企業または製造業者と専門的な関係はありません。 謝辞 この研究によってサポートされていましたNIH NIAMSのからの助成金R01AR053220、(HJIに)R01AR062136(HJIに)、R21AR067035(HJI)とAR05947(GXに)だけでなく、VA BLD&Rは、(HJIに)レビュー賞に値する、国立研究財団韓国 – 2012R1A1A2005306(JSKへ)および中国国家自然科学基金助成金(81472049 からGXへ)。我々はDrsと同様にHope Organ Tissue Donor Networkの贈り物に感謝します。ヒト組織を利用可能にしたChubinskayaとMargulis 、そしてそれを可能にした組織提供者の家族にも感謝の意を表します。 参考文献 1 GB アンダーソン 慢性腰痛の疫学的特徴 Lancet 、354 (1999 )、pp。581 – 585 記事のダウンロードPDFを見るScopus Google Scholar 2 AC シュヴァルツ、CN Aprill 、R. ダービー、J. フォルタン、G. キネ、N. 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