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ハイライト

VEGFR2を標的とすることは、炎症性関節炎モデルにおいて続発性異痛を予防する。

抗VEGFR2は、後角における血管のICAM - 1およびミクログリアを減少させる。

抗VEGFR2は脳内皮細胞への単球の付着を阻害する。

我々は疼痛を促進する新しい神経膠血管免疫メカニズムを提案する。

治療用抗VEGFR2は、炎症性関節炎における慢性疼痛を軽減し得る。
抽象
慢性疼痛は、炎症性関節炎などの症状に反応して発症する可能性があります。ミクログリアとアストロサイトの役割の証拠があるものの、人間の慢性的な痛みの開発と維持の根底にある中心的なメカニズムは十分に解明されていません。しかしながら、炎症性関節炎のモデルを含む疼痛の前臨床モデルでは、CNS内の病的グリア反応性の役割を示す豊富な証拠がある。痛みを伴う炎症性関節炎のラットの脊髄後角では、CD11b +ミクログリア様細胞とGFAP +の両方が有意に増加していることがわかりました。血管に関連する星状細胞、および接着分子ICAM-1を発現する活性化血管の数。これは潜在的な神経膠血管活性化を示す。関節炎ラットにおけるVEGFR2を標的とする薬理学的介入を使用して、内皮細胞活性化を阻害することで、後角ICAM-1 +血管の数、CD11b +ミクログリア、および中枢性感作の指標である二次性機械的異痛症の発症をすべて防止した。誘導性Tie2特異的VEGFR2ノックアウトによる内皮VEGFR2の標的化はまた、炎症性関節炎に反応してマウスにおける二次異痛症および後角における神経膠血管活性化を防止した。インビトロでのVEGFR2の阻害炎症メディエーターTNF -αおよびVEGF - A165で刺激した場合、ICAM - 1依存性単球の脳微小血管内皮細胞への接着を有意に遮断した。a。まとめると、本発明者らの知見は、新規のVEGFR2媒介脊髄神経膠血管機構が末梢CD11b+循環細胞のCNS実質への遊走を促進し、炎症性関節炎における慢性疼痛の発症に寄与し得ることを示唆している。我々は、この神経膠血管の活性化および脊髄への循環細胞の移行を防止することが、慢性関節リウマチによって引き起こされる疼痛に対する新しい治療戦略となり得ると仮定している。
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キーワード
炎症性疼痛慢性関節リウマチ慢性の痛み機械的異痛VEGFR2神経膠血管活性化ICAM-1CD11bミクログリア、単関節炎
1 。前書き
慢性関節リウマチ患者が経験する疼痛は慢性的で衰弱性であり、そして炎症の適切な制御にもかかわらず持続し得る(Taylorら、2010年、HeibergおよびKvien、2002年、McWilliamsおよびWalsh、2016年)。慢性関節リウマチの疼痛を引き起こすメカニズムは複雑であり、末梢の炎症、関節の損傷、末梢の侵害受容過程および中枢性感作を含み、後者が慢性疼痛を支えると考えられている。この複雑な病因のために、患者は様々な形で非誘発性疼痛を経験し( Walsh and McWilliams、2012 )、異痛症(無害な刺激に対する疼痛)を患っている。痛覚過敏(痛みを伴う刺激の感覚が高まる)( Meeusら、2012、Wendlerら、2001)。さらに、疼痛に関連した心理的苦痛および疲労はさらに生活の質を混乱させる(Rocheら、2003年、Ulusら、2011年)。慢性関節リウマチの現在の治療法は、全身性および関節関連の炎症を抑制することを目的としており、ある程度の成功を収めているが(Walsh and McWilliams、2012)、痛みを抑制することができないことが多い。したがって、最適な炎症制御に直面しても持続する疼痛のより良い制御に対する差し迫った必要性が依然として残っている(McWilliams and Walsh、2016、Emery、2012)。
慢性関節リウマチなどの慢性炎症性疾患もまた、これらの患者における広範な内皮「機能不全」を増加させる心血管リスクと関連している(Steyers and Miller、2014 )。中枢神経系(CNS)微小血管を含む、脊髄、神経維持もっと高度に選択的な血液脳/脊髄関門(BBB / BSCB)を形成し、他の場所で哺乳類の身体における微小血管系とは異なる恒常性。BBB / BSCBは、内皮細胞、血管 周皮細胞(Graeberら、1990)、星状細胞末端および血管周囲マクロファージを含む(HickeyおよびKimura、1988)。、Graeberら、1989)。星状細胞の末端は微小血管系を包み込み血管機能を調節する。例えば、星状細胞エンドセリン-1の放出は血管収縮性であり(Macrae et al。、1993 )、星状細胞単球誘引物質タンパク質-1 はヒト脳内皮を横切る白血球遊走を促進し、これは細胞間接着分子-1(ICAM-1)を阻害することにより阻止できる。( Weiss et al。、1998 )。より最近の研究は、ミクログリア腫瘍壊死因子 – アルファ(TNF-α)が神経膠血管活性化を刺激し、内皮プロスタグランジンI 2を促進することを示します 受容体発現およびこのメカニズムは神経因性疼痛の発生に寄与する(Kanda et al。、2017)。CNS微小血管系とは対照的に、感覚後根神経節(DRG)における微小血管関門は有窓であり、それほど制限的ではない(Abramら、2006年、Anzilら、1976年、Jacobsら、1976年、Segond von Banchetら、J。 、2009年)。
免疫細胞(単球/マクロファージ、リンパ球、好中球および肥満細胞)、グリア(星状細胞およびミクログリア)および血管内皮は全てCNSおよび末梢の両方における感作疼痛経路の発達に寄与し得る[(ScholzおよびWoolf、2007年)。)]。ミクログリアは、実質に移行する増殖中の住居用ミクログリアまたは循環骨髄細胞に由来するCNS自然免疫細胞である(Hessら、2004、EglitisおよびMezey、1997、Lawsonら、1992、Yaoら、2016)刺激されたミクログリアは、TNF -α、インターロイキン-1βおよびインターロイキン-6などの侵害受容促進因子を放出することができる(Ledeboerら、2005年、 Raghavendraら、2004年、 Ohtoriら、1976年)。これらはニューロンの発火の増加を促進し、情報伝達を促進し( Konigら、2016年、 Reeveら、2000年)、そして侵害受容系において潜在的に感作ニューロン状態に寄与する(中枢感作)。その結果、ミノサイクリンなどのミクログリア活性を阻害する薬剤は、前臨床疼痛モデルにおいて抗侵害受容特性を有する(Ledeboerら、2005年、 Zhangら、2012年、Chen et al。、2013、Sagar et al。、2011)。
TNF -αと共に、血管内皮成長因子-A(VEGF - A)タンパク質は、慢性関節リウマチ患者の血清中で増加する(Nakaharaら、2003)。VEGF-AおよびTNF-αは、VEGF-A 165 aおよび内皮接着分子の両方の内皮発現を促進するTNF-αと関連している(Nowak et al。、2008)(Haraldsen et al。、1996、Radisavljevic et al。 、2000)。抗TNF -α療法(例えば、エタネルセプト)は、慢性関節リウマチにおけるVEGF - Aレベルを有意に減少させることができる(Strunkら、2006年、Maciasら、2005年)。抗TNF療法に反応しない患者のVEGF-A濃度は有意に上昇したままであるか、さらにはさらに上昇する可能性があります(Knudsenら、2009)は、非応答者におけるTNF非依存性VEGF − A発現を示し、そして代替の治療標的を示唆している。VEGF-Aを調節する血管機能を介して内皮活性化を含むVEGF受容体2血管新生促進VEGF-スプライスバリアントVEGF-:(VEGFR2)165 のトリガー内皮発現ケモカインを含む細胞表面接着分子ICAM-1 (Kimらをら、2001)、そして脳内皮細胞を横切る免疫細胞の遊走を刺激する(Leeら、2002)。さらに、組換えヒト(rh)VEGF − A165a(完全受容体アゴニスト)は侵害受容促進作用を有するが、部分的rhVEGF-A 165 b に対するVEGF受容体は侵害受容に対して反対の作用を有する(Hulse et al。、2014、 Hulse et al。、2015 )。髄腔内阻害剤注射によるなど、正常動物におけるVEGFR2を特異的に標的とすることもまた、げっ歯類の侵害受容行動に有意に影響を及ぼす(Hulseら、2014年、 Hulseら、2016年)。
今日まで、VEGFR2を標的とすることが侵害受容過程をどのように乱すかは不明である。抗VEGFR2が神経因性疼痛の前臨床モデルにおいて抗侵害受容性であるという知識を用いて、我々は、VEGFR2を標的とすることが炎症性単関節炎モデルにおいて抗侵害受容性であると仮定した。白血球が他の前臨床疼痛モデルにおいて脊髄実質および後根神経節に遊走するにつれて(Zhang et al。、2016、Zhang et al。、2007また、VEGF - Aは、脊髄後角および後根神経節内皮が炎症性関節炎において活性化されるであろうという仮説を立てた内皮「活性化因子」である。内皮活性化の結果として、VEGFR2を標的とすることは内皮活性化および反応性脊髄ミクログリアの数を減少させ、それによってインビボでの抗VEGFR2の抗侵害受容効果のための新規メカニズムおよび治療のための新規標的を提供する炎症性関節炎における慢性疼痛。
2 。材料および方法
すべての動物処置は、英国の動物(科学的処置)法1986年/改正規則2012およびノッティンガム大学動物福祉および倫理審査グループの承認に従って行われた。動物は、標準飼料および水を自由に用いて、21±2℃ で12時間/ 12時間の明/暗サイクル下に維持した。合計70匹の雄Wistarラット(Charles River UK、開始体重200〜250 g)および119 匹のトランスジェニック実験マウスをこの研究に使用した。
2.1 。動物用住宅のデザイン、グループの無作為化および標本数
実験群割り当てをケージごとに無作為化しながら、ビヒクル投与vegfr2 fl / fl Tie2CreER T2 マウスを除いて、各ケージにおいて可能なケージ間相互作用を最小にするために全ての群の混合があることを確実にしながら無作為化した:Tie2CreER T2誘導に用いたタモキシフェンまた、その活性代謝物は尿中に存在します(Kisanga et al。、2005 )。この排泄物同じケージ内でビヒクル投与動物とタモキシフェン投与動物との間で交差汚染が起こる可能性があるため、これらのマウスは別々に収容した。ラット(2段ケージ)およびマウス(1段ケージ)をケージあたり4つおよび4〜6つずつ個別に換気されたケージに収容した。動物の福祉チェックは実験を通して毎日行われた。主な尺度は同側の機械的閾値挙動であり、それゆえサンプルサイズはこれらのモデルを用いた以前の実験(Chillingworth and Donaldson、2003、Hsieh et al。、2015、Kelly et al。、2007)および未発表のパイロットスタディに基づいた。
2.2 。関節炎の誘発
完全変性フロイントアジュバント(CFA)を、熱変性マイコバクテリウム結核[英国農務省水産食品、現在はDEFRA、英国]を2mg / mLの鉱油に再懸濁し、超音波処理(1時間)し、濾過(40μm)して調製した。孔径)。ラットに短時間のイソフルラン麻酔下(酸素中2〜3%)でCFA100μg(油50μL中)を片側関節内(脛骨大腿)注射した。注射されていない対照ラットは、年齢/性別が一致しており、炎症を抑制するために使用された。注射による油および関節の損傷は、結果の解釈を混乱させる炎症を引き起こすのに十分であるため、CFAビヒクルは対照動物に注射しなかった。トランスジェニックマウスは、片側性皮下ペリを受けた。タモキシフェン導入の2週間後、イソフルラン麻酔(酸素中2〜3%)下で関節の両側にCFA [40 xL油中2 x 80μgCFA、Chillingworth and Donaldson、2003]の非関節(脛骨内)注射。偽マウスは、CFA注射なしで麻酔および注射部位調製を受けた。したがって、これはラットの研究に匹敵する非炎症対照群、すなわち総炎症に対する対照群であり、CFA単独の作用ではなかった。
2.3 。全身抗体および薬理学的阻害剤投与
VEGFR2シグナル伝達は、PBS中20μg / kgのVEGF − A165b [VEGF受容体競合拮抗薬(Kawamuraら、2008)、抗血管新生VEGF − Aアイソフォーム(Woolardら、2004)、の腹腔内注射によって標的とされた。K. Ballmer-Hofferから受け取った。PBS中15mg / kg PTK787 [VEGFR1 / VEGFR2阻害剤、バタラニブ二塩酸塩、Selleckchem(Woodら、2000 )、またはBBB浸透性が高い(Remkoら、2011 )、またはPBS中12μg/ kg DC101 [中和マウス -特異的抗VEGFR2抗体(IgGmAb、BioXcell)]。DC101 免疫グロブリンのオフターゲット効果をコントロールする(IgG)、対照動物には、種/濃度が一致したIgG(MP Biomedical、同じ経路/ビヒクル)を与えた。腹腔内阻害剤注射は、関節内CFAの直後および後の時点で行った(結果を参照)。
2.4 。局所抗体および薬理学的阻害剤投与
VEGFRAシグナル伝達は、0日目および7日目のVEGF − A165b[20ngのCFA注射(0日目)および50μLのPBS(7日目)]またはPTK787の関節内(局所)注射によって右脛骨大腿関節を標的とした。[100pmolでCFAを注射した(0日目)および50μLのPBS中(7日目)]。
2.5 。侵害受容行動および関節腫脹の測定
全ての行動アッセイは実験群に対して盲検で行われた。試験前3日間にわたって、動物を操作者の取り扱いおよび試験環境に慣れさせた。試験前に動物を20分間再順応させた。機械的刺激除去を以前に記載されているように記録した(Hulse et al。、2014 ):von Freyモノフィラメント(マウス:0.04〜2g;ラット:0.16〜26g)を各後足に〜5秒間5回適用した。得点された回答の割合。Graphpad Prism 7を使用して、刺激 – 反応の関係 [加えられた力の対数(10を底とする)に対する反応の割合をプロットすることによって生成される] から50%引き下げ閾値を計算した。同側および反対側(CFA注射に対する)後肢無力容量試験機(Linton Instrumentation、英国)を用いて重量分布を測定した。各後肢が負担する体重を3秒間にわたって平均し、3回の読みの平均を計算した。結果は、後肢にかかる総体重の割合として同側後肢体重負荷として表示される。覚醒状態のラットの脛骨大腿骨関節直径および覚醒中のマウスの脛骨大腿骨関節直径をデジタルノギスを用いて記録した。読みは3回行い、平均値を計算した。
2.6 。脊髄とDRG免疫蛍光
関節炎症の誘発から8日後および11日後にラットをペントバルビタールナトリウム(60mg / ml)で最終的に麻酔し、〜250mLの氷冷PBS +ヘパリン(1U / mL)、続いて〜250mLの氷冷4%パラホルムアルデヒドで灌流固定した。 PBS中の(PFA)。これらのラットにおいて有意な二次異痛症が発症したため、これらの時点で組織を採取し、そして前日(7および10日目)に治療による疼痛行動の変化が観察された。試験デザインは、同じ日に一連の行動測定および組織収集を可能にしなかった。このモデルの我々の経験では、二次的機械的異痛症は1週間後にピークに達する(Drake et al。、2016したがって、二次疼痛が確認されたときに、組織分析のための時点を選択した。マウス脊髄を上記のように灌流固定し、14日目の対側行動の有意差が観察された時点での行動試験の完了後に解剖した。脊柱をPFA中に一晩、次いでPBS中の30%スクロース中に72時間まで入れた。脊髄腰椎肥大(後肢感覚入力および二次感受性部位に対応する中心部位、L4-L5( Butler and Comparative、2005 )および同側および対側性の腰椎後根神経節)(膝からの感覚入力の大部分に対応する神経節、L3(Russellら、2012)を解剖し、ドライアイス上で最適切断温度(OCT)化合物(VWR、UK)中で凍結させた。 (20μm)の凍結切片を切断し、スライド(SuperFrost®プラス、VWR)上に解凍マウント。切片をPBS中で再水和した+ 0.2%トリトンX-100(PBS-X)と(10%遮断ウシ胎児血清、5%ウシ血清アルブミン室温で2時間、PBS-Xに溶解した。切片の厚さのため、ブロッキング溶液中の一次抗体を4℃で一晩インキュベートし、スライドをPBS-Xで洗浄した(3回、10分)。スライドをブロッキング溶液(4℃、湿潤条件)中で二次抗体と共に一晩インキュベートし、上記のように洗浄した。最後にスライドをストレプトアビジンと共に室温で 2時間インキュベートし、上記のように洗浄し、Fluoroshieldにマウントした。一次抗体:グリア原線維酸タンパク質(GFAP)(Abcam、ab7260、pAb抗血清)を500分の1で使用。CD11b(ミクログリア/単球マーカー)(BioRad、MCA275)を0.2μg / mLで使用した。ICAM-1(活性化内皮細胞マーカー)(Abcam、ab171123)を0.2μg/ mLで用いた。IB4(Sigma、L3759)を1μg / mLで使用した。VEGFR2(Cell Signaling、55B11)は250分の1で使用し、CD31は5μg / mLで使用した(R&D Systems、AF3628)。二次抗体(ヤギ抗マウス/ウサギ、Alexa Fluor標識、Life Technologies)はすべて1000分の1で使用した。ストレプトアビジン-488(Life Technologies)を500分の1で使用し、Hoechst543334を1μg/ mLで使用した。
2.7 。共焦点顕微鏡および分析
蛍光像は、×10、×40および×63油浸対物レンズを用いたLeica SPE共焦点顕微鏡およびLe​​ica Applications Suiteソフトウェア(LAS X)を用いて捕捉した。画像解析にはImageJソフトウェアを使用した。CD11b+/ Hoechst総後角細胞数をImageJを使用して自動化した:後角(ラミナIV)を追跡し、次いでCD11b+およびHoechst 1024×1024解像度8ビット画像を、全群にわたって一貫した設定で閾値処理し、そしてオーバーレイの割合を決定した。パーティクルアナライザと測定機能を使用します。CD11bの> 35%重層核+の信号のCD11bとみなされました+細胞。このパーセンテージは、パイロット手動分析からの手動カウントと一致するように最適化されています。後角GFAP、CD11bまたはICAM-1免疫蛍光シグナルは、シグナルが血管に局在する場合には血管関連であると手動で定量化した。ラット研究において、血管を示す核染色で局在する蛍光シグナルがあれば、GFAP、CD11bまたはICAM-1関連血管が同定された:縦方向/斜めの血管は、2つ以上の細長い平らな核の鎖によって同定された(内皮細胞または周皮細胞)。、点線の省略記号は、図1 H、I、L)及び横断後角容器は、三日月又は完全なリング(内皮細胞又は周皮細胞点線省略記号を形成する2つの以上の湾曲した核によって同定された、図1、F、I)。Tie2-CreER T2でVEGFR2 KO研究は血管の局在化をCD31共染色で補助した。全ての手動ICAM - 1+、CD11b+およびGFAP+血管分析は、実験群に対して盲検化された分析器を用いて行われた。動物当たりのICAM − 1+、CD11b+またはGFAP+関連血管断片の数を数え、分析した動物当たりの総断面積にわたって分析し、分析した総面積の差を説明した。
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図1。関節の炎症は、二次的な機械的異痛症、神経膠血管の活性化および脊髄のミクログリア反応性を促進します。脛骨大腿関節直径(a)、同側後足にかかる体重(b)、同側機械的刺激離脱閾値(c)、および対側機械刺激(d)関節内CFA後の離脱閾値(単回投与、100μg)、n = 9(CFA)、n = 4(非炎症対照)。免疫反応性炎症性関節炎の誘発後8および11日目の後角におけるGFAPおよびCD11b抗体の発現。(e〜f)非炎症対照における後角におけるGFAP(赤)およびCD11b(緑)免疫反応性の増加を示す代表的な画像(e、g、k)、(g〜j)8日目および(k〜l)11日後の誘導CFAによる関節炎(核)。高倍率画像化は、GFAP+星状細胞末端(赤、矢印)で囲まれ、CD11b+細胞(緑、矢印)に囲まれた、平坦(縦)または湾曲(断面)核のストリング(青)で識別される微小血管を明らかにした 8日目(h、i)。CD11b+を示すzスタック再構成後の2D画像血管内腔内に細胞突起を有する細胞(j)。11日目までに後角実質内に広がった後角CD11b+ミクログリア様染色。8日目(n)および11日目(m)に非炎症対照(mr)およびCFA処置動物の後角におけるICAM − 1発現を示す代表的な画像。後角全体にICAM - 1+微小血管断片(p)が観察された。ICAM-1 + 免疫反応性はCD31 +血管(q)およびGFAP +で包まれた血管と関連していた星状細胞のエンドフィート(r)。統計分析:二元配置反復測定分散分析+ダネットの多重比較検定。CFA +ビヒクル対それぞれのベースライン:*** p、<0.001、**** p <0.0001。グループサイズ= 8〜9 データは平均±SDとして表示されている。(この図の凡例の色への参照の解釈については、読者はこの記事のWeb版を参照してください。)
2.8 。Tie2-CreER T2 × vegfr2 fl / flマウスの作製
我々はfloxPサイトのいずれかの側でVEGFR2遺伝子についてホモ接合性であるマウス交差抗VEGFR2薬の作用部位解明するために、エクソン 1(VEGFR- FL / FL)(アルバカーキら、2009 Tie2CreER付き)T2のマウスを[ヨーロッパ誘導性内皮vegfr2 ノックアウト成体マウスを作製するためのMutant Mouse Archive EM:00715(Forde et al。、2002)。実験は両性のF3 / F4マウスで行った。使用した全てのマウスは、VEGFR2 − loxP導入遺伝子(vegfr2fl / fl)についてホモ接合性であり、そしてTie2CreERT2についてはヘテロ接合性または野生型のいずれかであることが確認された。
2.9 。タモキシフェンTie2CreER T2 vegfr2 fl / flノックアウト
タモキシフェン(Sigma、T5648)をエタノールに溶解し、次いでオートクレーブしたヒマワリ油(ビヒクル10%エタノール、90%油)で10分の1に希釈した(Acharyaら、2011)。タモキシフェンの作用に対する対照として、1日5回用量のタモキシフェン(1mg / 100μL i.p.)またはビヒクル(容量/経路適合)をTie2CreERT2陽性マウスまたはTie 2 CreERT2陰性マウスのいずれかに投与した。
2.10 。内皮細胞ノックアウト特性化のためのCD31 +細胞選択
タモキシフェン/ビヒクル誘導の2〜4週間後、マウスを経心的に灌流し(20mLのPBS +ヘパリン10U / mL)、〜100mgの肺または脊髄組織を解剖し、PBSで2回洗浄し、そして酵素的に(0.125%コラゲナーゼP、1時間)。細胞分散物を37℃)で機械的に解離させ(P1000マイクロピペットで粉砕)、40μmセルフィルターを通過させ、MSカラムを使用し、製造業者の説明書(Miltenyibiotech)に従ってマウスCD31+選択マイクロビーズアッセイ(2000万細胞)に入れた。
2.11。VEGFR2ゲノムDNAとmRNAのキャラクタリゼーション
CD31陽性細胞選択後、ゲノム DNA(Qiagen、DNeasyキット)およびRNA( Chomczynski and Sacchi、1987)(CD31陽性、カラムフロースルーおよび入力画分)を抽出し、精製した。野生型vegfr2遺伝子(F − R1、3222bp)を検出するように設計された1つのフォワードプライマー(F)および2つのリバースプライマー(R1、R2)を用いる従来のPCRによってゲノムDNA(〜100ng)を増幅した。以前に実施されたように(Albuquerqueら、2009年、Sisonら、2010年)、vegfr2遺伝子(F1-R3、ノックアウトされていない439 bp、またはノックアウト産物218 bp)。)アニーリング温度65℃、プライマー:F。5 − CTTTCCACTCCTGCCTACCTAG − 3。R1、5 – TGGAGAGCAAGGCGC-TGCTAGC-3。R2、5 − AATTTGGGTGCCATAGCCAATC − 3)。RT-PCRにより VEGFR2 mRNAの変化を調べるために、500μgのRNAをDNaseIで処理し、500 ngのOligo-d(T)および250 ngのランダムプライマーおよびM-MLV 逆転写酵素(all Promega)で逆転写した。1μLの全20μLの相補的DNA(cDNA)を2.5μLのTaqmanプローブ+ 9μLのddH2O + 12.5μLのプローブ用ddPCRスーパーミックス(Bio - Rad)に添加した。QX100液滴発生器(Bio − Rad)を使用して25μLから70μLの液滴油(Bio − Rad)を添加することによって液滴を生成した。VEGFR2またはCD31 cDNAの増幅標準的なTaqmanプロトコル(10分間の活性化工程95℃ 、94℃ で30秒間の変性を40サイクル、60℃で1分間のアニーリング、およびPCR熱サイクルを用いた98℃での最後の10分間の伸長)を用いて行った。 VEGFR2(KDR、Mm01222421_m1)およびPECAM1(CD31、mM01242584_mi)Taqman Primer(Life Technologies)を用いて試料を分析し、陰性および陽性対照の結果に基づいて手動で閾値処理を行った。値の自動しきい値設定が不可能だった場合に限ります。
2.12。VEGFR2 / Tie2フローサイトメトリー
CD31 + 肺細胞または脊髄細胞の選択に続いて、細胞をカルセインAM(2.5μM、20 ‘、37℃)とインキュベートし、次いでマウスTie2に対する蛍光色素標識抗体(PE結合、Biolegend#124008、10μg / mL)で染色した。 )およびマウスVEGFR2(APCコンジュゲート、Biolegend#136406、10μg / mL)、および全核をHoechst543334で染色した。フローサイトメトリーのTie2リビングの割合の変化を決定するために行った(MoFlo Astrioのセルソーター)+及びVEGFR2を+細胞。単一色素対照群は、4つの色素間でシグナル補正が不要であることを確認した(Hoechst 543334:350〜488/59 nm、Calcein:488〜513/26 nm、PE:561〜579/16 nm、APC:640〜671/30)。 nm)。肺からの試料において、カルセイン陽性(生きている)細胞の側方散乱および前方散乱は、2つの異なる集団、低Tie 2 / VEGFR 2陰性集団および高Tie 2 / VEGFR 2集団を明らかにした。これら2つの集団におけるTie2およびVEGFR2発現の変化をタモキシフェン誘導マウスと非誘導(ビヒクル処理)マウスとの間で調べた。脊髄からのサンプルでは、​​側方散乱特性および前方散乱特性によって分析した場合、生きた細胞の異なる集団は明白ではなかったので、すべての生きたCD31 +細胞をTie 2およびVEGFR 2発現について分析した。
2.13。ヒト脳内皮細胞 – 単球接着アッセイ
ヒト脳微小血管内皮細胞(HBMEC)をRPMI + 20%FBS、2mM L−グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、1%MEM非必須アミノ酸、1%MEMビタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシン中で培養した。ヒト単球(THP − 1、Sigma)をRPMI + 10%FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン中で培養した。HBMECを96ウェルプレートに30,000細胞/ウェルで播種し、処理をRPMI + 1%FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン中で行った。内皮単層を、組換えヒトTNF -α(R&D Systems)で24時間処理する前に、VEGF - A165b、ZM323881(20nM)またはPTK787(100nM)のいずれかで一晩前処理した。ブロッキングICAM-1抗体(100ng / mL)または濃度および種適合IgG(100ng / mL、ms IgG)を、TNF -α処理と共にそしてまた単球添加時に添加した。単球を2.5μMカルセイン-AMで37℃で1時間蛍光標識し、温PBS中で洗浄し、1ウェルあたり30,000細胞でHMBEC単層に添加し、付着のために2時間インキュベートした。付着していない単球を洗い流し、細胞を4%PFAで固定した。カルセイン蛍光は、蛍光プレートリーダー(Victor X 4、Perkin-Elmer)で測定した。示されている結果は、未処理群の平均蛍光値(刺激なし)を差し引いたものであり、次いで最大応答の平均蛍光の百分率として表されている。
2.14。ウエスタンブロッティング
HBMECおよびヒト臍帯静脈微小血管細胞(HUVEC)タンパク質溶解物を、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むRIPA溶解緩衝液(P8340、Sigma)中の〜80%コンフルエントの培養細胞から調製した。サンプル(10μg)を4〜20%グラジエントゲル(Bio-Rad Mini-PROTEAN®TGX™Precast、90Vで90分間)上のSDS-PAGEで分離し、ターボトランスファー(Bio-Rad TransBlot)でニトロセルロースメンブレンに転写したターボ、25Vで7分間)。メンブレンをα-オクルディン(71〜1500、ウサギ、0.5 µg / mL)、α-von Willebrand Factor(ab6994、ウサギ、17μg/ mL)、またはα-アクチンのいずれかとインキュベートしました。(sc1615、ヤギ、0.5μg / mlをローディングコントロールとして使用した)。使用した二次抗体はIRDye®680RDロバ抗ウサギIgG、IRDye®800CWロバ抗マウスIgGまたはIRDye®800CWロバ抗ヤギIgG、すべて0.2 µg / mLで、メンブレンはLiCor Odyssey Fcで可視化しました。
2.15。データ抽出と統計分析
得られたデータをGraphPad Prism v6を用いて処理しグラフ化した。全てのデータはガウス分布であり、平均±標準偏差として示されている。統計的比較のために、各動物は実験単位であった。一元配置または二元配置分散分析と事後ダネットの多重比較検定を用いて3つ以上の群を比較して、それぞれの対照群との有意差を試験した。機械的閾値スコアと組織学的データとの間の有意な相関について試験するためにスピアマン相関分析を行った。
3 。結果
3.1 。関節内完全フロイントアジュバントは後角星状細胞、ミクログリアおよび微小血管反応性を促進する
関節内CFAに反応した疼痛行動と後角ミクログリア、星状細胞および微小血管の反応性を最初に調べた。CFAは、脛骨大腿部直径の有意な増加(図1a)、同側後足 にかかる体重の有意な減少(図1b)および同側後足の機械的閾値の有意な減少(図1c)を引き起こした。対側後肢の機械的閾値はsensiziationを示すベースラインの65%に、10日目の減少が、これは、それぞれのベースライン(と比較して統計的有意性に達しなかったP = 0.056)も、非炎症コントロール(と比較してP = 2ウェイANOVA +事後分析により分析0.071)、図1 のD)。同側後足の機械的閾値(二次的機械的異痛)の有意な減少は、中枢性感作の発達を示した。多くの慢性疼痛性疾患および動物モデルにおいて、後角の反応性星状膠細胞およびミクログリアが中枢感作および疼痛の発生に寄与している(Taylorら、2017、MifflinおよびKerr、2017 )。したがって、後角グリア線維性酸性の変化を調べた。感覚入力に対応する脊髄レベルでのタンパク質(GFAP、反応性アストロサイト)およびCD11b(反応性ミクログリア)発現二次感受性部位(感作後足、L5)から。八日関節内CFA後、GFAP発現は(赤は、で表される、より顕著であった矢頭、図1 H、I、J)非炎症対照よりも図1のE-F)とのCD11bの少数がありました+細胞(緑色、矢印で示す、図 1g〜j)は、炎症を起こさない対照においては観察されなかった。この時点で、ある割合のGFAP免疫反応性および観察されたCD11b+細胞の大部分は、微小血管を示す核染色と関連しており 、そして画像再構成は、GFAP+突起(反応性星状細胞末端)を、CD11b+細胞が存在する血管様構造の周りに巻き付けた(図11i、jで強調表示)。説明の目的のために、微小血管を示す核染色は、高倍率画像において点線の楕円によって囲まれている(図1f、h、i、j、l)。11日目にGFAP免疫反応性は微小血管と関連していたが、CD11b + 細胞は後角実質 全体に広がっていた(図1  k、l)。GFAPの数+同側後角に微小核染色に関連付けられている反応性星状細胞エンドフィート0.41から増加±0.07×10 -5  ミクロン-2(非炎症)1.35±0.09×10-5  μm-2(8日目)および1.02±0.22×10-5  μm-2(11日目)。11日目に、CD11b+ミクログリア様細胞は、後角実質において広がっており(図  1k、1)、0.05%±0.09(非炎症)から8.93%±1.17(全細胞の%)まで増加していた。
CD11bは、脊髄損傷後の活性化血管内皮を介した白血球の接着および血管外遊出における重要な分子である、 ICAM-1の天然のリガンドである(Springer、1990 )(Isaksson et al。、1999)。末梢炎症の結果としての後角活性化内皮におけるICAM-1発現の増加は、CNS実質内へのCD11b +細胞の経内皮移動に寄与し得る。非炎症動物と比較して(図1m)、実際にICAM - 1+の数の有意な増加があった。8日目および11日目のCFA動物の後角全体の血管(微小血管核染色に関連する緑色の細長い構造、図1n − p)、(非炎症性0.22±0.22×10-5  μm-2、8日目11.67±0.10× 10 -5  ミクロン-2、11日目11.64±02.07×10 -5  ミクロン-2 )。ICAM - 1およびCD31の同時染色により、CFA処置動物の後角におけるICAM - 1+微小血管が確認された(図1q)。GFAP(赤)とICAM-1(緑)の同時染色でも、GFAP +星状細胞終末端に関連するICAM-1 +微小血管が同定されました。r)CFA動物の後角。
3.2 。炎症性関節炎において抗VEGFR2薬の腹腔内投与は関節内投与は行わない
脊髄内皮活性化は、中枢内皮活性化を低下させることが、CNS内の血管関連有害な変化を予防するための経路であり得ることを示唆した。VEGF − AがVEGFR2を介してICAM − 1を誘導することが示されているので(Usuiら、2004)、我々は以前にVEGF − Aが疼痛状態に関与することを見出した(Hulseら、2014、Hulseら、2015)。、Hulseら、2016)、我々は、抗VEGFR2剤の全身送達によるVEGFR2の阻害が、末梢作用ではなく中枢作用を介して疼痛関連行動の発達に影響を及ぼすかどうかを調査しようとした。VEGFR2を標的とするために、我々は天然に存在するVEGFR2部分アゴニスト、VEGF − A165bを使用した(Kawamuraら、2008)。血管作用を阻害し(Ourradi et al。、2017)、抗侵害受容特性(Hulse et al。、2014、Hulse et al。、2015 )、高いBBB 浸透性を有する小分子VEGFR1&2阻害剤、PTK787( Remko et al。) 。2011年、抗侵害受容特性を有する)(ハルスら。、2014、ハルスら、2015 )およびマウス特異的VEGFR2の中和抗体自由BBB、交差しないDC101を。VEGF-A 165 b(20μg/ kg ip、図2)、PTK787(15 mg / kg ip、図2 )のいずれかの2回の全身投与(0および3日目)。)またはDC101(12mg / kg i.p.、図2)は、対照図2a)と比較して関節直径に有意に影響を及ぼさなかった。VEGFR2中和抗体DC101およびVEGF - A165bは両方とも、10日目までの体重負荷のシフトに対して有意な阻害効果を有していた(図2b)。3日の抗VEGFR2処置は全て、7日目のCFA +対照と比較して同側後足における二次的機械的異痛症の発症を有意に抑制した(図2c)。CFAは、対照動物において反対側の後肢閾値の低下を誘発したが、これはそれぞれのベースラインから有意には達しなかった。しかし10日目には両方VEGF-A 165bおよびDC101処置は、10日目の対照動物と比較して同側足にかかる体重の有意な増加を引き起こした(図2d)。全身送達とは対照的に、関節内抗VEGF剤(VEGF - A165bまたはPTK 787)は、同側後足における二次的機械的異痛症の発症に影響を及ぼさなかった(図3a、d)、後足重量のシフト。反対側への支え(図3b、e)も、関節腫脹も図3c、e)。これらの結果は示している全身 VEGFR2シグナル伝達の阻害ではなく、地元の膝における抑制は抗侵害受容性であり、関節における局所的VEGF - A受容体の抑制とは異なるメカニズムを示唆している。さらに、特定のVEGFR2中和IgG DC101を含む、3つの全身投与された抗VEGF剤すべての機械的異痛症に対する効果は、作用の中心部位を示唆する。CNS実質内に自由には入り込まないであろうDC101の抗侵害受容効果は、脈管構造自体の中に可能性のある阻害部位を示している。
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図2。抗VEGFR2剤の全身送達は、二次的機械的異痛症の発症を予防する。関節内CFA +マウスVEGFR2特異的中和抗体(DC101)、VEGF − A165bまたはPTK787のいずれかの関節内CFA + 2回の腹腔内注射後の脛骨大腿関節直径(対照IgG)(a)。DC101(マウス中和VEGFR2 mAb)、PTK787(VEGFR1&2阻害剤)またはVEGF − A165b(競合的VEGF受容体拮抗薬)のいずれかによる処置後のCFA注射と同側の足への体重負荷。同側後足CFAおよびVEGFR2阻害後の機械的感受性(c)。反対側の後足の感度(d)。2つの統計解析を行った:二元配置反復測定分散分析+ダネットの多重比較検定:CFA +対照IgG対各ベースライン、* p <0.05、** p、<0.01、*** p <0.0001。またはCFA +薬物対CFA +対照IgG所与の時点で、♯p <0.05。♯♯p<0.01、♯♯♯p<0.0001、♯♯♯♯p<0.0001。グループサイズ= 5〜9 データは平均±SDとして表示されている。 高解像度画像をダウンロードする(628KB)フルサイズの画像をダウンロード 図3。VEGF受容体阻害剤の関節内(脛骨大腿)送達は、炎症性単関節炎のCFAモデルにおける疼痛関連行動の発達に影響を及ぼさなかった。関節内(IA)CFA(単回投与)を加え測定した全ての時点における2回のIA車両注射(矢頭)同側の機械的刺激引っ込め閾値の有意な減少を引き起こした(D)、同側に担持重量後足(Bをe)(1〜10日目)およびそれぞれのベースライン(0日目)と比較した脛骨大腿関節直径の有意な増加(c、f)。CFA + VEGF-A 165 bまたはPTK787の2回注射(矢頭)は、疼痛関連行動および関節直径(a〜f)の発達に影響を及ぼさなかった。2つの統計分析を行った:二元配置分散分析+ダネットの多重比較検定:CFA +ビヒクル対それぞれのベースライン、*p  <0.05、**p  <0.01、***p  <0.0001。またはCFA +ビヒクル対CFA +薬物、#p  <0.05、## p  <0.01、### p  <0.0001。AC n = 10、DF n =5。データは平均±SDとして表示されている。 3.3 。脊髄後角のグリア反応性に対する抗VEGFR2剤の効果 局所的ではなく全身的に投与した場合、抗VEGFR2剤が二次疼痛行動を抑制したので、抗VEGFR2治療後の後角におけるCFA誘発性反応性グリアおよび微小血管の変化を調べた。GFAPラップ血管様構造の数は、両方の8日目にCFA +対照群の同側および対側後角の両方で増強された4。図 i)および11日目、-D 4図)J、EH、およびのみDC101治療はGFAPで包まれた血管の数に有意な影響を及ぼした(同側、8日目)。図1(g〜j)に観察されるように、非炎症対照動物と比較して、8日後に後角実質において少数の有意でない数のCD11b+細胞が検出された。図4a − d、k。図1i、j)。しかしながら、検出されたもののうち、有意な数(CD11b+細胞、矢印図4a− d)が全てのCFA群の後角微小血管系と関連して検出され、末梢炎症に関連する微小循環におけるCD11b+細胞の上方制御を示唆する。図4a − d、l)。関節内CFAの11日後までに、CFA処置動物の同側および対側の後角実質内に有意に増加した数のCD11b+細胞が存在した(図4)。ええと、m)。すべてのVEGF阻害処置は、11日目に脊髄実質内のCD11b+細胞の数を減少させたが、これはVEGF − A165bおよびPTK 787についてのみ有意に達した。有意な数のこれらのCD11b+細胞が、非炎症対照と比較して、そして各それぞれの8日目の数と比較して、微小血管系と関連していた(図4e〜h、n)。これは、処置が血管から周囲の実質へのCD11b +細胞の移動を減少させたことを示唆した。後角CD11b +の有意な増加11日目の細胞数は同側後足の機械的閾値と有意にそして負に相関した(補足図S1)。VEGF - A165b群(GFAPで包まれた血管の数、11日目、図4j)を除いて、各群内の同側と反対側との間に差は観察されなかった。 高解像度画像をダウンロードする(2MB)フルサイズの画像をダウンロード 図4。関節炎に対する星状細胞およびミクログリアの反応性に対する抗VEGFR2薬の効果。関節内CFAは、(a)8日目と(e)11日目の両方において同側後角のGFAP + 末端巻き血管断片の数の有意な増加を引き起こしたが、DC101による治療(b、f)、 VEGF-A 165 b(c、g)もPTK787(d、h )も、 8日目(i)では同側および反対側のGFAP +末端巻き血管断片の数を有意に減少させたが、 11日目(j)では減少させなかった。 。関節内CFAは微小血管関連CD11b +の有意な増加を引き起こした8日目(k)および11日目(1)の細胞(同側および反対側)の細胞は、両方の時点でCFA群間で差は観察されなかった。8日目には、コントロールと比較して、後角実質におけるCD11b+細胞の数に有意な差はなかった(m)、一方11日目には、非炎症と比較して、後角実質におけるCD11b+細胞の有意な増加があった。コントロール動物。VEGF-A 165 b(同側および同側)およびPTK787(同側)のみが統計的有意性に達したが(n)、3つの抗VEGF処置すべてがこの数を減少させた。それぞれの同側および対側効果の間の唯一の有意差はVEGF-A 165で観察されたb 11日目にGFAPで包装された船舶の数をグループ化する(j)。3つの統計解析を行った:二元配置分散分析+ダネットの多重比較検定:対照対非炎症* p <0.5、** p <0.01、*** p <0.001、**** p <0.0001。抗VEGFR2薬対対照(イプシまたはコントラ):#p <0.5、## p <0.01、### p <0.001、#### p <0.0001およびイプシ対各グループのコントラ+ p <0.5 。8日目:n = 4。11日目:n = 4–5。データは平均±SDとして表示されている。 3.4 。後角血管ICAM ‐ 1発現に対する抗VEGFR2剤の効果 VEGF-Aを阻害することは、インビトロでICAM-1発現および単球接着を阻害することができる(Radisavljevic et al。、2000、Thichanpiang et al。、2014)。CD11b+細胞は、最初は微小血管と関連しており(8日目)、後角後実質に位置していた(11日目)。したがって、末梢炎症が角質内皮へのCD11b +細胞の遊走の可能性を裏付けることができる後角内皮ICAM-1発現の増加を引き起こしたという仮説を検証した。対照動物と比較して、CFA処置動物におけるICAM-1 +血管は、8日後の後角全体に存在した(図5)。a)、DC 101、VEGF-A 165 bまたはPTK 787 処置群では8日目にはほとんど見られなかったが(図5 b-d)、11日目には見られなかった(図5 e-h)。数の定量ICAM +血管はVEGF-、CFAは有意DC101減少した8日目に、脊髄の両側に有意な増加を誘導することを示した165 BまたはPTK787 図5)は、i。ICAM - 1誘導は11日目でなお明白であったが(図5j)、VEGFR阻害はこの時点では効果がなかった。DC101群を除いて、各群内で同側と反対側の間に差はなかった(8日目、図5 i)。ICAM-1の有意な阻害8日目の抗VEGFR2処置による+微小血管は、実質内へのCD11b+ミクログリア様細胞の遊走を減少させた可能性がある(図  4m)。 高解像度画像をダウンロード(1MB)フルサイズの画像をダウンロード 図5。後角血管活性化に対する抗VEGFR2剤の効果 後角におけるICAM-1 免疫反応性の代表的な低倍率画像(a〜h)。 後角に存在するICAM-1 + 微小血管の数(i、j)。3つの統計解析を行った:二元配置分散分析+ダネットの多重比較検定:対照対非炎症* p  <0.5、** p  <0.01、*** p  <0.001、**** p  <0.0001。抗VEGFR2剤対対照(イプシまたは対照):#p  <0.5、##p  <0.01、###p  <0.001、####p  それぞれの群の対照群に対して<0.0001およびipsi + p <0.5。8日目:n = 4。11日目:n = 4–5。データは平均±SDとして表示されている。 3.5 。後根神経節血管ICAM ‐ 1発現に対するVEGFR2阻害剤の効果 DRGへの炎症細胞の浸潤は、化学療法誘発性疼痛(Zhangら、2016 )、糖尿病性ニューロパチー(Rahmanら、2016)、および外傷性神経損傷(Austinら、2015)の一因となっています。ICAM - 1 / VEGFR2二重染色は、両方の分子がCFA単関節炎を有する動物のDRGにおいて発現されたことを示した(図6a)。ICAM-1染色は、CFA誘導性動物から同側DRG中に著しくより頻繁であった図6のB、C)、これはそれほどDC101とともにた図6のD)、VEGF- 165 B 図6 e)及びPTK708 図。 6f)治療 同側のL3 DRGではICAM - 1+血管の数が有意に増加したが、非炎症対照と比較して8つの図6i)および11日後には図6j)。3つ全てのVEGFR2阻害処置は、8日目と11日目の両方でICAM - 1+血管の数を有意に減少させた(図  6g、h)。いずれの群においても、マクロファージ(CD68+細胞)は、8日目にDRGにおいて観察されなかった(データ示さず)。 高解像度画像をダウンロード(860KB)フルサイズの画像をダウンロード 図6。VEGFR2阻害は、DRGにおけるICAM - 1発現を減少させる。炎症性関節炎の誘発から8日後の同側L3後根神経節における ICAM-1およびVEGFR2 免疫反応性(a)。ICAM - 1発現は、VEGFR2を発現するDRG微小血管に局在していた(スケールバー〜10μm)。対照IgG、DC101、VEGF − A165bまたはPTK787による治療を伴う炎症性関節炎の誘発の8日後のL3 DRGにおけるICAM − 1発現を示す代表的な画像(b〜f)。矢印はICAM-1 +を示します血管の破片 一次ならびに種および濃度が一致したアイソタイプはIgG染色をコントロールしない(g、h)。スケールバー – 100μm。8日目(i)および11日目(j)に抗VEGF処置した、非炎症またはCFA注射動物からの同側および反対側のL3 DRGにおける微小血管ICAM − 1発現の定量化。統計分析:g、h:一元配置分散分析+ダネットの多重比較検定:対非炎症* p <0.5、** p <0.01、*** p <0.001、**** p <0.0001。対CFA + IgG対照:#p <0.5、## p <0.01、### p <0.001、#### p <0.0001およびそれぞれの群のipsi対対照+ p <0.05、++ p <0.01 、+++ p <0.001、++++ p <0.0001。8日目:n = 3〜4。11日目:n = 4–5。データは平均±SDとして表示されている。 3.6 。蛍光単球接着アッセイにおける培養ヒト脳微小血管内皮細胞におけるVEGFR 2の標的化 VEGF-A 165 aおよびTNF-αは、内皮細胞(Radisavljevicら、2000、Hiranoら、2017)、網膜色素上皮細胞(Thichanpiangら、2014、Lee)におけるVEGFR2の活性化を介してICAM-1発現を上方制御する。ら、2015)、および慢性関節リウマチ 滑膜細胞(Hulseら、2015、Lindsleyら、1993)。)ICAM - 1上方制御および単球付着に対する効果がCNS内皮に対するVEGFR2阻害剤の可能性のある直接作用に起因するという仮説を検証するために、我々はヒト脳微小血管内皮細胞(HBMEC)単層を使用した。内皮表現型は、フォンビルブラント因子についての免疫ブロットによってHBMECにおいて確認された(vWF、図7a、HUVEC陽性対照)。これらの細胞はオクルディンも発現しており、これはタイトジャンクションの形成を示している。漸増濃度のTNF -αで処理した細胞は、HBMEC単層への蛍光標識単球(THP - 1)の付着がTNF -α処理によって有意に誘導され、これがICAM - 1との同時処理によって有意に減少したことを示した。ブロッキング抗体 図7b)。VEGF - A165a(24時間)による処理もまた蛍光THP - 1単球付着の有意な増加を引き起こし(図7c)、そしてVEGF - A165b前処理はこの付着を有意に阻害した(図7c)。特異的VEGFR2阻害剤(20nMのZM323881、図7d、e)またはPTK787(100nM、図7d)による前処理および同時処理もまた、VEGF − A165a誘導性THP − 1単球付着を有意に阻害した。 ICAM - 1遮断抗体の添加と同様に、HBMEC、図7c)。VEGF-A165と同様の方法でA、TNF-α処理(24時間)が取り付けられたTHP-1単球の蛍光の増加を引き起こした図7のD)VEGF-でブロックすることができる165 B、抗VEGFR2化合物または遮断ICAM-1抗体 図7 のD )したがって、中枢神経組織由来の内皮細胞へのTNF -α媒介THP - 1単球接着は、VEGFR2依存性であると思われる。 高解像度画像をダウンロード(423KB)フルサイズの画像をダウンロード 図7。VEGFR2を標的と すると、インビトロで脳内皮細胞への単球接着が減少した。2つの異なる初代ヒト脳微小血管内皮細胞(HBMEC)培養物およびHUVECにおける内皮関連タンパク質フォンビルブラント因子およびオクルディン−1の発現(a)。TNF -αまたはTNF -α+ICAM - 1遮断抗体を用いてまたは用いないで処理した後の培養脳内皮単層に付着した蛍光単球の代表的な画像、スケールバー= 100μm(b)。選択的VEGFR2阻害剤ZM883231(ZM、20nM、1時間)、VEGF − A 165b(10ng / ml、24時間)、VEGFR1&2阻害剤PTK787による前処理の効果(PTK、100nM、1時間)またはICAM-1ブロッキング抗体(濃度、時間)またはVEGF-A 165 a誘導単球接着に対する非特異的IgG、n = 9(c)。TNF -α誘発単球接着に対するVEGF - A165b(24時間)、PTK787(1時間)、またはICAM - 1遮断抗体またはZM323881(1時間)による前処理の効果(d)。統計分析:一元配置分散分析+ダネットの多重比較検定:未処理* p <0.5、** p <0.01、*** p <0.001、**** p <0.0001。対それぞれの対照:#p <0.5、## p <0.01、### p <0.001、#### p <0.0001。略語 抗体 – 抗体; HBMEC – ヒト脳微小血管内皮細胞。HUVEC – ヒト臍帯静脈内皮細胞。vWF – フォン・ヴィレブランド因子。VEGF − A – 血管内皮増殖因子−A。TNF-α – 腫瘍壊死因子-α; ICAM − 1 -細胞間接着分子−1。接着アッセイ:n = 9〜20(3つの独立した実験から照合された個々のウェル)。データは平均±SDとして表示されている。 3.7 。Tie2CreER T2を介したVEGFR2ノックアウトの特性評価 末梢性炎症性疼痛モデルを開始する前に、我々は肺および脊髄におけるVEGFR2ノックアウトを特徴付けた。VEGFR2 ゲノム KO産物は、タモキシフェン処理Tie2CreER T2 vegfr2 fl / flマウス由来のCD31 +細胞でのみ検出され、(ビヒクル処理Tie2CreER T2 vegfr2 fl / fl(非誘導)マウスまたはTie2CreER T2陰性(野生型)マウスでは検出されなかった。 VEGFR2内皮細胞ノックアウト(VEGFR2ECKO)を示す(補足図2)Tie2およびVEGFR2発現レベルをCD31+肺(補足図2)およびCD31におけるフローサイトメトリーによって分析した。+脊髄細胞(補足図3)。両方のサンプルにおいて、VEGFR2ECKOは生存可能なTie2+細胞の数(肺、21.1±6.3%減少、脊髄の42.6±8.3%減少)およびVEGFR2を発現するTie2+細胞の数(肺48±6.9%減少)を有意に減少させた。、脊髄45.4±12.1%)(補足図2および3)。 3.8 。誘導性Tie2CreER T2媒介VEGFR2ノックアウトは炎症性関節炎モデルにおける疼痛関連行動の発達に影響を与えた 後足の機械的刺激閾値は、投与開始後2週間にわたり、ベースラインまたはそれぞれのビヒクル処置対照群と比較して、VEGFR2ECKOまたはvegfr2fl / fl:wtマウスのいずれにおいてもタモキシフェン処置によって影響を受けなかった(補足図4a)。。CFA炎症はVEGFR2に誘導しECKOと2つの対照群[ VEGFR2 FL / FL:Tie2CreER T2車両(非誘導、で処置したマウス。図8)およびVEGFR2 FL / FL:、タモキシフェンで処置したWT 図9 ]によってペリ関節足首関節注射。CFAは、それぞれのベースラインまたは偽注射と比較して、2日目以降、両方の対照マウス群において測定された同側後足の機械的刺激閾値の有意な低下を引き起こした。8aおよび9a)。VEGFR2ECKOマウスでは、CFAは5日目以降からのみ同側の機械的刺激閾値の有意な減少を引き起こし、これは2日目の非誘導群とは有意に異なった(図8a)および2日目のvegfr2 fl / fl:wt +タモキシフェン群。そして5 図9a)。CFAはまた、それぞれのベースラインまたは擬似対照と比較して、5日目以降の対照マウス群において測定された反対側の後肢の機械的閾値の有意な減少を引き起こした。対照的に、VEGFR2ECKOマウスは反対側の機械的感受性を発達させなかった。8 B&9のB)。CFAは、2、5、8および14日目に、それぞれの偽動物と比較して、非誘導対照マウスにおける反対側の後足への体重負荷の有意なシフトを引き起こしたが、VEGFR2ECKO動物においては5日目にのみ有意なシフトが観察された。2日目に、VEGFR2ECKOと両方の対照群との間に有意差があった。8 c&9c)。3つの群全てが、実験の過程にわたって、CFA後に同側脛骨基部関節直径の有意な増加を生じた。8 d&。9 D)と有意差のみVEGFR2との間の14日目に観察されたECKO及び非誘導マウス図8 のD)。行動評価の完了後、同じマウスからのCD31+肺細胞においてVEGFR2mRNAのレベルを測定して、継続的なノックアウトを確認した。KOマウスにおいて検出されたVEGFR2 mRNAは有意に減少した(非誘導マウスの57.2±4.3%、n = 5、補足図4b)。 高解像度画像をダウンロード(635KB)フルサイズの画像をダウンロード 図8。内皮VEGFR2ノックアウトは、非誘導対照動物と比較して疼痛行動に影響を及ぼした。同側(a)および反対側(b)は、対照(非誘導)動物における後肢の機械的刺激閾値を示している。VEGFR2ECKOマウスでは、機械的刺激閾値の低下は、非誘発対照マウスと比較して、(a)同側​​後足で有意に遅延し、(b)反対側後足で有意に防止された。体重負荷におけるCFA誘発性シフトの有意な阻害も2日目(c)に観察され、そして14日目までに関節直径の有意な減少があった(d)。組換えヒトVEGF-A 165の開始から2および5日後の機械的異痛治療(8ng / g i.p.隔週)(g)。統計分析:bf、h:二元配置反復測定分散分析+ダネットの多重比較検定。それぞれのベースライン(0日目)に対して:*p  <0.5、**p  <0.01、***p  <0.001、****p  <0.0001。所与の時点でのそれぞれの対照に対して:## p  <0.01、### p  <0.001、#### p  <0.0001。f:スチューデントのt検定、* p  <0.05。a:n = 3。b:n = 10–11。cf n = 5 – 6。g、h。n = 5。CFA、完全フロイントアジュバント。データは平均±SDとして表示されている。 高解像度画像をダウンロードする(550KB)フルサイズの画像をダウンロード 図9。内皮VEGFR2ノックアウトは、タモキシフェン処置Tie2CreER T2野生型対照動物と比較して疼痛行動に影響を及ぼした。ノックアウト実験グループおよび非誘発実験グループ(図8参照)に加えて、関節周囲CFA実験にはタモキシフェン処置Tie2CreERT2陰性(野生型)グループが含まれた。同側(a)および反対側の有意な減少(b)非誘導対照群において観察されたように、これらのマウスにおいて発生した機械的刺激閾値(図8参照)。。これらの効果は、ノックアウト群とは有意に異なっていた(イプシ:2日目、対照:全時点)。体重増加におけるCFA誘発性シフトの有意な阻害も2日目(c)に観察されたが、関節腫脹の差は観察されなかった(d)。統計分析:二元配置反復測定分散分析+ダネットの多重比較検定。各対照対それぞれのベースライン(0日目):*p  <0.5、**p  <0.01、***p  <0.001、****p  <0.0001。または与えられた時点での試験群対それぞれの対照:## p  <0.01、### p  <0.001、#### p  <0.0001、n = 5–6。データは平均±SDとして表示されている。 別の実験では、ノックアウトマウスとコントロールマウスをタモキシフェン治療の2週間後にrhVEGF-A 165 a [8ng / g 体重 ip、後肢機械的異痛症をもたらすことが知られている(Hulse et al。、2014)]で治療した。隔週のrhVEGF-A 165 a処置は、後肢の機械的閾値の有意な減少を引き起こした(図 8e )。対照的に、rhVEGF-の隔週治療165 におけるノックアウトマウスは、機械的閾値に影響を及ぼさなかった、これは試験した2つの時点で対照マウスとは有意に異なっていた図8のE参照)。 VEGFR2ECKO炎症性関節炎行動アッセイの完了後、本発明者らは、後角(14日目組織)におけるGFAP、ICAM − 1およびCD11bの発現レベルを調べた。関節周囲CFAは、偽非誘導マウスと比較して、GFAP+反応性星状細胞終末端に関連する後角CD31+血管の数(神経膠血管応答)の有意な増加を引き起こした。図10a、b、m、n。 p)VEGFR2ECKOマウスでは偽の非誘発対照と比較してGFAP+星状細胞終末端に関連する血管の数も有意に増加したが、VEGFR2ECKOではCFA処置であった。マウスはこれをさらに有意に増加させなかった図10c、d、p)における定量化。CFAは、CD11bの数の有意な増加に起因+ CD31に関連する細胞+血管およびICAM-1の数+ / CD31 +シャムと比較して非誘導マウスにおいて血管を図10 E、F、I、J、または)が、CEGの同じ効果は、VEGFR2ECKOマウスでは観察されなかった。図  10g、h、k、l定量化(q&r)。どちらの分析でも、各グループ内の同側と反対側の間に有意差はありませんでした。CD11b +の数が少ない細胞は後角実質において検出され、CFAはこれに有意な影響を及ぼさなかった(補足図5)。 高解像度画像をダウンロードする(2MB)フルサイズの画像をダウンロード 図10。VEGFR2ECKOは、CFA処置マウスの後角における神経膠血管活性化を阻害した。関節周囲CFAは、非誘導マウスにおける偽と比較して、GFAP+反応性星状細胞足突起(神経膠血管応答)に関連する後角CD31+血管の数の有意な増加を引き起こした(a、b、pにおける定量)。偽処置非誘導対照と比較して、偽処置VEGFR2 ECKOではGFAP +星状細胞足突起に関連する血管数が有意に増加したが、VEGFR2 ECKOではCFA処置が行われた。マウスはこれをそれ以上有意に増加させなかった(c、d、pにおける定量)。CFAは、偽と比較して、非誘導マウスにおけるCD31+血管に関連するCD11b+細胞の数およびICAM - 1+血管構造の数の有意な増加を引き起こしたが、同じ効果があった。 VEGFR2ECKOでは観察されなかった(qおよびrにおけるg、h、k、l定量)。GFAP+反応性星状細胞末端足(m、n、矢印はGFAP+/ CD31+血管構造を示す)、血管に関連するCD11b+細胞の高倍率画像(n、矢印はCD11b+を示す)CD31+血管構造に関連する細胞、点線矢印は実質CD11b+細胞を示し、ICAM - 1+血管(○、矢印はICAM - 1+/ CD31+血管構造を示す)。3つの統計分析を行った:二元配置ANOVA +ボンフェローニ多重比較検定:対非誘導偽擬似*p  <0.05、**p  <0.01。KO CFAとKOシャムコントロール – 意味なし。それぞれのグループの対照とイプシとの対比 – 意味はありません。n = 3〜6。データは平均±SDとして表示されている。 4 。討論 VEGFR2の薬理学的ターゲティングは、疼痛の多くの前臨床モデルにおける侵害受容に影響を及ぼす(Hulseら、2014年、Hulseら、2015年、Hulseら、2010年、Nesicら、2010年、Linら、2010年、Nagai et al。、2014)、しかしこの過程に関与するVEGFR2の細胞内位置およびその根底にあるメカニズムは明確には解明されていない。ここで我々は、内皮 VEGFR2の阻害がラットの二次疼痛行動の発達を妨害するという証拠を提供する(BBB / BSCBを自由には通過しない抗VEGFR2抗体を含む全身薬理学的阻害、図2)。)および誘導性内皮VEGFR2 ノックアウトマウスにおいて(図9)。逆に、抗VEGFR2剤の関節内注射による局所的VEGFR2の標的化(図3)は、二次的機械的異痛症に影響を及ぼさず、全身性VEGFR2阻害の抗侵害受容効果が炎症部位における阻害機構によって誘発されないことを示す。ジョイント。二次疼痛様行動の抑制(感受性の広がり)は、PNSおよび/またはCNSにおける内皮作用部位を示す。内皮活性化とのCD11bの数減少全身抗VEGFR2治療+ 腰椎におけるミクログリア様細胞脊髄膝関節の炎症に反応した後角実質(図4および5)およびDRGにおける内皮活性化(図6)。さらに誘導性内皮ノックアウトは、足首関節の炎症に反応して神経膠血管の活性化を妨げた。これらの結果は、脊椎とDRGの微小血管系を強調しています。末梢炎症における侵害受容過程の発達に寄与している可能性があり、そして疼痛の拡大における内皮VEGFR2の重要性を示している。このモデルを用いたさらなる研究は、観察された脊髄神経膠血管反応が炎症を起こした関節に対応するセグメントに限定されるのか、それともCNS内でより広範囲に及ぶのかを調査することができる。結果は、全身性炎症に反応しての感覚求心性神経媒介神経膠血管反応またはCNS神経膠血管活性化のいずれかを示すであろう。反対側のDRGにおけるICAM-1 +アップレギュレーションの欠如は、臍帯の両側で観察された脊髄神経膠血管活性化が、広範囲ではなくCFA誘発同側末梢駆動に反応していたことを示す。 全身性炎症に対する血管の反応。反対側の脊髄で観察された重要な効果は、体性感覚/侵害受容器シグナル伝達を含む交連ニューロンシグナル伝達の結果であると思われる( Comer et al。、2015)。 CNSにおける反応性グリアおよび単球/マクロファージ浸潤は、慢性神経変性症(Rezai− Zadehら、2009年)および自己免疫疾患(Winer、2001年、Ziff、1989年)、ならびに脳卒中などのCNS損傷(Gronbergら、2004年)の一般的な特徴である。 、2013年、Michell − Robinsonら、2015年)。反応性星状細胞およびミクログリア様細胞は、長期にわたる複雑な局所疼痛症候群の患者の脊髄後角に見られる( Del Valle et al。、2009 )。ラット末梢坐骨神経において傷害において、ミグログリア細胞マーカーIba1を発現する後角細胞のかなりの割合が、脊髄実質に遊走し、反応性ミクログリア様表現型に分化した循環単球/マクロファージに由来することが見出された(Zhangら、2007年、Echverryらら、2011 )。この過程が起こるためには、脊髄内皮は、BSCBを横切る単球遊走のための接着分子を発現するように刺激される必要がある。さらに、住宅のミクログリアと末梢単球の両方が神経損傷後の急性から慢性疼痛への移行に必要とされる免疫細胞は慢性疼痛の発症に関与しています( Peng et al。、2016)。我々の所見は、CD11b+単球の脊髄後角実質への経内皮遊走が末梢炎症後に起こり、血管VEGFR2媒介ICAM-1誘導性接着によって制御されることを示唆している。循環単球はまた、前臨床炎症性疼痛モデル(Segond von Banchetら、2009)において、感覚神経節の血液神経関門を横切って遊走し、そしてマクロファージ様表現型を呈し、そしてCD68+マクロファージは、抗原誘導においてDRGに移動する関節炎の進行(Jochmann et al。、2015)血管ICAM-1発現の増加にもかかわらず、DRG中のCD68 +細胞は観察されなかった。脊髄両側のGFAP、CD11bおよびICAM-1発現ならびに同側DRGに関する我々の知見は、神経系内皮VEGFR2が後角における内皮ICAM-1発現および炎症性関節炎におけるDRGを促進することを示している。CD11bは、反応性ミクログリア(Sedgwickら、1998)ならびに好中球、単球、ナチュラルキラー細胞およびリンパ球のサブセット上に発現される(Springer、1990、Kawaiら、2005)。CD11bは、ICAM-1、サブ内皮との相互作用を介して活性化内皮への強固な白血球接着に寄与する 基底膜成分および周皮細胞( ThompsonおよびMatsushima、1992、 Lundgren-Akerlundら、1993、 Bohnsackら、1990、 Dingら、1999、 Schmittら、2018)。11日目までのラット脊髄実質におけるCD11b+細胞の減少は、反応性微小血管系が実質内へのCD11b+細胞の遊走および/またはVEGFR2媒介機構による住居用ミクログリアの活性化に寄与することを示唆している。脳卒中モデルでは、脳の周皮細胞は微小血管系から放出され、実質内に移動し、CD11b +ミクログリア様表現型に分化する(Ozen et al。、2014)。本研究では、後角神経膠血管活性化は、後角実質内のCD11b +細胞の増加のための代替的な供給源を提供する同様のプロセスを引き起こす可能性がある。本発明者らの誘導性内皮VEGFR2 KO研究では、非誘導対照マウスにおいて、実質ミクログリア様細胞の数の有意な増加は、CFA投与の14日後の後角では検出されなかった。しかしながら、血管およびICAM-1 +血管構造に関連したCD11b +細胞数の有意な増加が観察され、これらは内皮VEGFR2 KOが予防した。これらの結果は血管関連CD11b +を示唆している末梢性炎症後に起こる中心的変化における細胞およびICAM-1血管発現は、内皮VEGFR2が続発性疼痛の発生を促進する血管機序を促進し得るというさらなる証拠を提供する。我々のラット研究において、8日目の後角微小血管系に関連するCD11b+細胞の数は炎症を起こした群の間で異ならず、これは抗VEGFR2処置が抑制機構による免疫細胞の成熟および循環への放出に影響しないことを示唆する。骨髄中 さらに、本発明者らは、非誘導マウス(データは示さず)およびVEGFR2 ECKO において、有意なTie2 + / VEGFR2 + 末梢単核細胞集団を検出することができなかった。ノックアウトマウスはまた、脾臓から単離された CD11b + 細胞の数に変化を示さない(Vedら、レビュー中)。したがって、KOが循環CD11b +免疫細胞の減少を引き起こし、その結果CD11b +細胞の脊髄実質への移動が減少し、抗VEGFR2の内皮作用部位が支持されたとは考えられません。インビトロ抗VEGFR2化合物による脳微小血管内皮細胞へのTHP-1単球接着の阻害は、仮説サポートインビボ VEGFR2の阻害はCD11bを減少させることができる+をVEGF − A媒介血管活性化およびICAM − 1発現の減少を介した単球接着および浸潤または脊髄への周皮細胞遊走。 VEGF − Aタンパク質は、慢性関節リウマチ患者の血清中で増加し(Nakaharaら、2003)、慢性狭窄損傷などの有痛性疾患モデルにおいてアップレギュレートされている(Linら、2010、Tangら、2009)。 I型糖尿病(Samii et al。、1999)。VEGFR2シグナル伝達の阻害は疼痛関連反応を減少させる(Lin et al。、2010)。VEGF-A 165 b、 VEGF-A のスプライスアイソフォームは血管内皮増殖因子受容体-2(VEGFR 2)の部分アゴニストであり、VEGFR 2への結合についてVEGF-A 165 a と競合する(Kawamura et al。、2008)。全身性VEGF-A 165b投与はまた、神経損傷におけるニューロン損傷および疼痛関連反応(Hulseら、2014年、Beazley - Longら、2013年)およびI型糖尿病モデル(Hulseら、2015年)を減少させることもできる。VEGF-AまたはVEGFR2の髄腔内遮断は、疼痛モデルおよび正常動物の両方において疼痛反応を阻害し(Zhangら、2011年、Hessら、2011年、Boettgerら、2010年)、およびrhVEGF-A 165 aの髄腔内送達を阻害する。正常な動物では侵害受容性が高い(Hulse et al。、2016)VEGF − A / VEGFR2の中枢侵害受容作用を示す。我々の知見と組み合わせると、全身性抗VEGFR2療法は、疾患が抗TNF -α治療によって抑制されている場合でも、炎症性関節炎患者にとって鎮痛効果がある可能性があるという説得力のある証拠がある。 我々が活性化血管を観察した時点は、急性全身性炎症反応とは対照的に、侵害受容器主導の中心的変化の結果である脊髄内皮活性化と一致している(Schaible and Schmidt、1988、Andrew and Greenspan)。 、1999)および中枢感作(Neugebauer and Schible、1988)は数時間以内に起こる。さらに、後角におけるICAM - 1+血管を包むGFAP+星状細胞終末端の数の増加およびこれらの変化のタイミングは、微小血管に対する星状細胞媒介メカニズムの可能性を提供する。炎症誘発性ニューロン入力に応答した活性化。ICAM - 1発現を伴うこのようなグリア – 血管共活性化は、免疫細胞浸潤と共に急性炎症における特定の脳領域においても見出され、そして炎症性疼痛における血液脳関門の完全性の破壊に寄与することが示唆される(Willis et al。 、2008年、Huberら、2006年)。本発明者らの発見は、末梢性炎症駆動神経膠血管活性化における内皮VEGFR2の機能を示す最初のものである。循環性単球を枯渇させることが、炎症性関節炎において抗VEGFR2と同様の抗侵害受容作用を生じる場合、これは、VEGFR2によって媒介される侵害受容促進性免疫細胞を移動させる直接的な証拠を提供するであろう。 抗VEGFR2処置の急性抗侵害受容効果(<8日)は、後角におけるCD11b+ミクログリアの増加に先行するので、後角における経内皮遊走の阻害に起因し得ない。rhVEGF 165 aの全身注射および局所注射は侵害受容器活性を直接推進することができる(Hulse et al。、2014)。それ故、全身性抗VEGFR2の急性抗侵害受容効果は、直接感覚ニューロン阻害の結果であり(Hulseら、2014)、および/または感覚における内皮VEGFR2の阻害による間接的な抗侵害受容効果であった可能性がある。神経、神経節および/またはCNS 8日目より前の時点で。本研究において、内皮VEGFR2ノックアウトを誘導することは、炎症の非存在下で全身性rhVEGF-A 165 a の急性侵害受容作用を防止した。受容体阻害の抗侵害受容効果と考えると、これらの知見は、内皮VEGFR2および内皮活性化を介して作用するVEGF − A165aが、二次過敏症ならびに脊髄の発達を支える初期侵害受容過程に関与すると結論づける。後角への免疫細胞の血管活性化および可能な経内皮遊走。 VEGFR2ノックアウトは、重度の血管欠損のために胎児にとって致命的であり(Shalaby et al。、1995 )、それゆえ我々が生成し、誘導可能なTie2特異的VEGFR2ノックアウトマウスを特徴付ける抗VEGFR2の作用部位を解明する。末梢炎症性疼痛試験における成体マウスの内皮VEGFR2の発現。最初に、肺におけるDNA、RNAおよびタンパク質レベル、ならびに脊髄におけるタンパク質レベルでの誘導性Tie2CreERT2VEGFR2ノックアウトを特徴付け、内皮(CD31+/ Tie2+)細胞におけるVEGFR2発現の有意な減少を明らかにした。VEGFR2 ECKO は生存CD31 +の有意な減少を引き起こした/ Tie2+細胞(肺および脊椎の両方において)は内皮生存度に対する効果を示している。VEGFR2ECKOはまた、CD31+/ Tie2+細胞(肺および脊椎の両方)によるVEGFR2発現の有意な減少を引き起こした。したがって、ノックアウトによって誘発される内皮VEGFR2発現の減少は、Tie2+/ VEGFR2+細胞のさらなる喪失の結果として、有意に過小評価される可能性が高い。VEGFR2ECKOノックアウトマウスはまた、成熟トランスジェニックマウスにおけるVEGFR2の生存の役割を支持する微小血管の直径および体積の減少を伴う異常な脊髄微小血管形態を示す(Vedら、レビュー中)。 5 。結論 炎症性関節炎はglio血管活性化、内皮せるICAM-1の発現および実質のCD11bの増加+ 腰椎の背角におけるミクログリア様細胞脊髄。さらに内皮VEGFR2を標的とすることは、炎症性関節炎において抗侵害受容性であり、そして後角における血管活性化およびCD11b+ミクログリア様細胞の数を減少させる。後角内皮活性化と実質的CD11b + 細胞の減少と機械的感受性の広がりとの関連は新規侵害受容メカニズムを提案するために導いた:脊髄神経膠血管活性化は侵害受容前免疫細胞の経内皮移動を促進する神経実質に集中し、中枢性感作および炎症性疼痛の拡大に寄与する。さらに、慢性関節リウマチ患者の血清中のVEGF-Aレベルの上昇は神経微小血管系を活性化し、免疫細胞の移動を促進し、したがって中枢性感作および潜在的に慢性疼痛状態の発症に寄与し得ると仮定する。本発明者らの結果は、血管作用および免疫細胞転座を防止するためのVEGFR2阻害剤が、既存の疾患修飾療法の補助として関節リウマチ患者に対する新たなさらなる治療戦略となり得ることを示している。 謝辞 この研究は、Arthritis Research UK [助成金番号20400、213338]、Medical Research Council [MR / K020366 / 1]、Diabetes UK [11/0004192]、およびNovartisによって支持された欧州糖尿病微小血管研究研究財団によって支援された。また、我々は感謝ノッティンガム大学生命科学イメージングユニットの学校(SLIM)と生物学的サービスユニット、ポール・スミス(ノッティンガム大学 HBMEC細胞用)、デビッド・オニオン(フローサイトメトリーユニット、ノッティンガム大学)。 利益相反 DOBとLFDは、Exonate Ltd.の創設者である株主です。DOBとLFDは、さまざまな状況下で治療薬としてVEGF-Aスプライスバリアントを保護する特許を共同開発しています。DOBはの従業員であり、LFDはノッティンガム大学のスピンアウト会社であるExonate Ltdのコンサルタントであり、同大学でも出資しています。他の作家は誰も競合する興味を持っていません。 付録A 。補足データ Acrobat PDFファイルのダウンロード(129KB)PDFファイルのヘルプ 補足資料1。CD11b + 後角実質細胞数およびICAM ‐ 1 +血管数対同側機械的刺激除去閾値の相関分析 関節内CFAによって誘発された後角CD11b+細胞の有意な増加は、前日の後肢の機械的閾値の減少と有意にそして負に相関した(a)。両方の時点で、投与角(b、c)とDRG(d、e)のICAM-1 +血管と同側の機械的閾値との間にも、有意かつ負の関連があった。統計解析:スピアマンの相関検定、n = 18〜21。 Acrobat PDFファイルのダウンロード(343KB)pdfファイルのヘルプ 補足資料2。タモキシフェン誘導Tie2CreER T2 VEGFR2ノックアウトを初代CD31 +肺細胞で調べた。VEGFR2ノックアウト遺伝子産物はCD31 +肺細胞でのみ検出され、タモキシフェン投与VEGFR2 fl / flからのフロースルー画分では検出されなかった:VEGFR2ノックアウトがタモキシフェンによって誘導され、CD31に特異的であることを示す Tie2CreER T2 陽性マウス+細胞(n = 3)(a)。生きているCD31 +細胞の2つの異なる集団(b;カルセイン+)は散布図(c)によって同定された。低いTie2 / VEGFR2陰性(非内皮)集団(d)、および高いTie2 / VEGFR2発現(内皮)集団(e)。KOマウスにおける内皮細胞集団Tie2 / VEGFR2の例(f)。VEGFR2ECKOおよび同腹仔対照における内皮集団中のTie2+細胞の数(d)。Tie2またはVEGFR2抗体のいずれかを単独で使用した対照染色は、チャンネル補償が必要ではないことを明らかにした(g、h)。非内皮細胞集団におけるTie2+細胞の数(i)。内皮集団におけるVEGFR2 +であったTie2 +細胞の割合(j)。Tie 2+ / VEGFR 2+であった総内皮集団の割合(k)内皮集団内の全てのTie2+細胞のVEGFR2中央蛍光値(1)。統計分析:学生のt検定:* p <0.5、** p <0.01。データは平均値±SD、n = 5〜6で表した。 Acrobat PDFファイルのダウンロード(335KB)pdfファイルのヘルプ 補足資料3。CD31 + 脊髄細胞におけるフローサイトメトリーによる内皮VEGFR2ノックアウトのレベルの調査 生きている脊髄CD31+細胞(α;カルセイン+、Hoechst+)の明確な集団は散布図によって同定されず(データは示さず)、すべての生きている細胞CD31+を分析した。おそらくミエリンを汚染している人為的な集団は、細胞と一致しない性質を示した(a)。非誘導マウス(b)およびVEGFR2ECKOマウス(c)におけるTie2 / VEGFR2の例。Tie2またはVEGFR2抗体のいずれかを単独で使用した対照染色は、チャンネル補償が必要とされないことを明らかにした(d、e)。実行可能CD31 + Tie2 野生型対照の倍数変化としての+細胞(f)および野生型対照の倍数変化としてのTie2+集団のVEGFR2+/ Tie2+(g)。統計解析:一元配置分散分析+ダネットの多重比較検定:対野生型対照、* p <0.5、** p <0.01、n = 5–8。データは平均±SDとして表した。 Acrobat PDFファイルのダウンロード(75KB)pdfファイルのヘルプ 補足資料4。VEGFR2ECKOは、非炎症マウスにおいて機械的閾値に影響を及ぼさず、CD31+肺細胞においてVEGFR2mRNAの長期持続的減少を引き起こした。タモキシフェンまたはそのビヒクルでの処置は、タモキシフェン投与の開始後2週間まで、VEGFR2ECKO、非誘導または野生型(wt)マウスのいずれにおいても機械的刺激閾値に影響を及ぼさなかった(a)。足首関節行動評価(タモキシフェン治療の4週間後)の完了後、ノックアウトマウスからの CD31 + 細胞におけるVEGFR2 mRNAのレベル誘導されていない対照と比較して57%低かったことは、ノックアウトの長期効果を示している。液滴RT-デジタル液滴PCRによって測定した。統計分析:スチューデントのt検定* p <0.05、n = 4〜6。データは平均±SDとして表した。 Acrobat PDFファイルのダウンロード(28KB)pdfファイルのヘルプ 補足資料5。足首関節の炎症は、14日目の脊髄実質においてCD11b+細胞の増加を引き起こさなかった。誘導されないおよびVEGFR2ECKOマウスの脊髄実質において無視できる数のCD11b+細胞が検出され、足首関節CFAはこの数を増加させなかった。 。二元配置分散分析+ボンフェローニの多重比較検定、n = 3〜6。データは平均±SDとして表した。 参考文献 Abram et al。、2006 SE アブラム、J. 李、A. フックス、ら。 損傷を受けた無傷の末梢神経および後根神経節の透過性 麻酔学、105 (1 )(2006 )、pp。146 – 153 Scopus Google ScholarのCrossRef ビューレコード Acharya et al。、2011 A. 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