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概要
目的
軟骨下骨は、変形性関節症(OA)における膝関節痛の発生において役割を果たす。本研究の目的は、モノヨードアセテート(MIA)誘発OAラットにおける大腿骨遠位部の軟骨下骨求心性神経の侵害受容表現型変化を明らかにすることであった。
方法
OAはラットのMIAの関節内注射によって誘発された。2つの異なる逆行性トレーサーを別々に膝関節腔および軟骨下骨に注入して、関節および軟骨下骨求心路を同定した。免疫組織化学をMIA注射後2週目(初期)および6週目(進行期)に用いて、侵害受容マーカー(カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)およびチロシン受容体キナーゼA(TrkA))の発現および体細胞サイズ分布を決定した。 CGRP免疫反応性(IR)ニューロン 組織学的軟骨下骨および軟骨損傷は、変形性関節症研究協会の国際評価システムに従って採点された。疼痛関連行動は、後肢の体重分布および機械的感受性を用いて評価した。
結果
OAは、関節および軟骨下骨求心性神経の両方において、CGRP、TrkAのアップレギュレーション、およびCGRP-IRニューロンの体細胞サイズの拡大を引き起こした。軟骨下骨求心性神経におけるCGRPおよびTrkAの発現は6週間にわたって徐々に増加した。さらに、軟骨下骨求心路におけるCGRPおよびTrkAの上方制御は、軟骨下骨損傷スコアと強い相関関係を示した。
結論
軟骨下骨求心性神経における侵害受容マーカーのアップレギュレーションは、軟骨下骨損傷と相関しており、特に進行期の膝OAの場合、軟骨下骨が治療標的であることを示唆している。特に、CGRPおよびTrkAは、軟骨下病変に伴う関節痛を治療するための潜在的な分子治療標的である。
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キーワード
変形性関節症軟骨下骨膝関節侵害受容表現型疼痛
前書き
膝の痛みは、変形性膝関節症(OA) 1の患者の身体障害の主な原因であり、病院への訪問の理由です。OA進行のメカニズムは十分に立証されているが、疼痛病態生理学はほとんど知られていない。最近の臨床エビデンスの蓄積2、3、4、5、6、7は、軟骨下骨の生成に役割を果たしていることを示している関節痛OA中を。上で検出された軟骨下骨髄病変(BMLs) 、磁気共鳴画像膝OA中(MRI)は強く激しい痛みに関連付けられている 2、3、4、5 。X線又は使用して軟骨下骨の平坦化又は鬱病のように定義される骨の摩耗、MRIは、強い疼痛の存在に関連している6、7。
軟骨下骨を神経支配する一次感覚ニューロンの細胞体は、後根 神経節(DRG)に位置する。カルシトニン遺伝子関連ペプチド免疫反応性(CGRP-IR)DRGニューロンは、によって調節される神経成長因子(NGF)及び炎症に非常に敏感であると考えられる 8。以前の研究では、高親和性NGF受容体チロシン受容体キナーゼA(TrkA)9に対して90%以上のCGRP-IR DRGニューロンが免疫染色されていたことが示されました9。私たちの以前の研究 10正常ラット膝関節の軟骨下骨を神経支配するDRGニューロンの大多数はCGRP-およびTrkA-IRであり、軟骨下骨は侵害受容刺激および炎症に対して非常に敏感であることを示唆していることを示した。しかし、膝OAの軟骨下骨を神経支配するDRGニューロンの侵害受容表現型の変化は明らかにされていない。
モノナトリウムことが報告されているヨードアセテートラットの膝関節に(MIA)の注入は、破壊軟骨細胞につながる、代謝を細胞死及び関節のその後の損失、軟骨、軟骨下骨とが変化する 11、 12。MIAモデルで観察された関節損傷は、OAにおいて観察された関節損傷と類似している 13、14。このモデルは、軟骨損傷と軟骨下骨変化の間の明確な相互関係を示しており、OA 14の進行における軟骨下骨の役割を研究するために使用することができます。
本研究の目的は、MIA誘発OAラットにおける大腿骨遠位部の軟骨下骨を神経支配するDRGニューロンの侵害受容表現型の変化を明らかにすることであった。具体的には、我々は侵害受容表現型の変化と軟骨下骨の組織学的損傷との関連性を評価した。2つの異なる逆行性トレーサーを別々に膝関節腔および軟骨下骨に注入して、関節および軟骨下骨求心路を同定した。免疫組織化学は、侵害受容マーカー(CGRPおよびTrkA)の発現およびCGRP − IRニューロンの体細胞サイズ分布を決定するために、MIA注射の2週間後(初期)および6週間後(進行期)に使用された。
材料および方法
動物たち
この試験では、雄のSprague-Dawleyラット(6週齢、体重250〜300 g)を使用しました。予備的研究により、 6週齢のラットにおいて、大腿骨遠位端骨端が骨端板によって骨幹端から完全に分離されていることが確認された。ラットを3つのグループに分けた:2週間、MIA注射の6週間後およびコントロール(食塩水注射)。36匹のラットを免疫組織化学試験に使用し、18匹のラットを組織学的試験に使用し、そして12匹のラットを行動試験に使用した。全ての実験は高知大学の動物実験委員会によって承認された。全ての結果の測定は、治療を盲検化した観察者によって行われた。
OAの誘導
ナトリウムペントバルビタール(30mg / kg、腹腔内)で麻酔した後、25μlの食塩水(Sigma − Aldrich、ミズーリ州セントルイス)または25μlの食塩水(対照群)中の3mgのMIAをラットに注射した。膝蓋骨靭帯を通して左膝関節内腔に挿入されたハミルトン注射器を有する27G針。
逆行ラベリング
MIAまたは食塩水注射の2または6週間後に、全てのラットをペントバルビタールナトリウム(30mg / kg、腹腔内)で麻酔した。剃毛後、左膝の外側面に20mmの皮膚切開を施した。逆行標識のために、1.5μlのFB(生理食塩水中10mg / ml; Polysciences、Inc.Warrington、PA)を10μlのDiI(1,1’-ジオクタデシル-3,3,3 ‘)と一緒に左大腿骨遠位端に注入した。1,3’-テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩、Molecular Probes)(N、N-ジメチルホルムアミド中5mg / mL)を左膝関節に注射した。両方のトレーサーを同じ関節に注射した。ハミルトンシリンジを備えた27Gの針を使用して逆行性トレーサーを注射した。大腿骨遠位端骨端へのFB注射は、1mmの穴を貫通して行った。大腿骨端の外側の皮質骨。FB拡散は、ハンドヘルドUV照明装置(365 nm波長)で確認できます。予備研究により、FBまたは黒インクが、OA(MIA注射後2週間および6週間)および対照( それぞれn= 6)のラットにおいて同様に関節内および骨幹への漏出なしに遠位大腿骨の内側顆および外側顆に浸透したことが確認された。(補足図1も参照)。トレーサーの周囲組織への漏出を防ぐために、ドリル穴をシアノアクリレートで密封した。注射部位は、手持ち式UV照射装置を用いたトレーサー漏れを検査し、洗浄しリン酸緩衝生理食塩水(PBS)。周辺組織へのトレーサー漏出の証拠を示した膝は、この研究から除外した。FBを留置した後、膝蓋骨靭帯を通して膝の関節内空間にDiI注射を行った。DiI注射後、創傷を4-0ナイロンで閉じた。FBおよびDiI注射の14日後、過剰量のペントバルビタールナトリウム(150 mg / kg、腹腔内)で動物を安楽死させ、左腰椎DRG(L 3、L 4)を得た。DRGを4%パラホルムアルデヒドに入れた。OCT化合物(Sakura Finetek、Torrace、CA、USA)に包埋し、そして切片にするまで-80℃で凍結した。次に、14マイクロメートルの凍結切片をクライオスタットを用いて切断した。Fro-Tissuer Pen(Agar Scientific、Stansted、UK)を使用して切片をスライドに載せた。
DRGの免疫組織化学
一次DRGニューロンの変化は、CGRPおよびTrkAの発現を用いて評価した。ニューロンの大部分は、遠位大腿骨の軟骨下骨がL3ののDRGニューロンに局在した神経支配のでL3及びL4を中心に局在していた膝関節を支配10、L3及びL4のDRGは、CGRPとTrkAのための免疫反応のために使用しました。切片をウサギ抗CGRP抗体(1:1000 T − 4032; Peninsula Laboratories、ベルモント、カリフォルニア州)およびヤギ抗TrkA抗体(1:200 AF1056; R&D System、ミネソタ州ミネアポリス)中で一晩インキュベートした。冷蔵庫。翌日、CGRPについてヤギ抗ウサギIgG-FITC(1:500 sc-2012; Santa Cruz Biotechnology、Inc. CA)および二次検出をウサギ抗ヤギIgG-FITC(1:500 sc-2777; 3:1)で行った。 TrkAのためのサンタクルーズバイオテクノロジー社)。すべて抗血清を、CGRP用の1%正常ヤギ血清およびTrkA用の2%ウサギ血清を含有するPBSで希釈した。各インキュベーション工程の前、間、および後に、切片をPBS中で5分間3回洗浄した。陰性対照として、代表的な切片を一次抗体なしで処理した。最後に、全ての切片をVectashield(Vector、Burlingame、CA)でマウントした。
切片をNikon Eclipse 80i顕微鏡(Nikon、東京、日本)で観察した。DRGの代表的な写真は、共焦点顕微鏡Olympus FV-1000D / IX81(Olympus、東京、日本)を使用して撮影した。各DRGから少なくとも50の切片を切り出し、二重計数の可能性を排除するために、目に見える核を有するFBおよびDiI標識ニューロンを5切片ごとに計数した。L3およびL4のDRGを免疫蛍光反応に使用したので、各ラットから合計で少なくとも100切片のDRGを切り出し、少なくとも20切片を評価した。
各FB標識ニューロンおよびDiI標識ニューロンについて、CGRPおよびTrkAを全FB標識ニューロンおよびDiI標識ニューロンの百分率として定量した。データは中央値および95%信頼区間(CI)として提示された。我々は、MIA注射および対照の6週間後の2週間で、FB標識ニューロンおよびDiI標識ニューロンにおけるCGRP−およびTrkA − IRニューロンの割合を比較した( 各群につきn= 6ラット)。
FB-およびDiI-標識CGRP-IRニューロンの体細胞サイズを調べた。測定エリアによれば、ニューロンは小さい(<600μmのように分類された2)、中(600〜1200ミクロン2)、及び大(>1200μmの2)15、16、17。本発明者らは、MIA注射および対照の6週間後の2週間後に、FBおよびDiI標識CGRP-IRニューロンの体細胞サイズを比較した( 各群につきn = 6ラット)。
膝関節の組織学的評価
軟骨下骨を特に参照した膝関節組織学を、MIA注射および対照の6週間後の2週間で評価した。膝関節を3日間10%ホルマリンに入れ、12日間ギ酸で脱灰し、そしてパラフィンに包埋した。5マイクロメートルの切片を切り出し、サフラニンOおよびファストグリーンで染色した。軟骨下骨および軟骨損傷は、変形性関節症研究協会インターナショナル(OARSI)等級付けシステム基準 18 に従って採点された。基準では、軟骨下骨損傷スコアは、0(最良)から5(最悪)までの数値尺度を使用していた。の最も深刻な病変各前頭切片の大腿顆を記録した。軟骨変性スコアについては、各前部切片上の内側大腿骨顆を等しい幅の3つのゾーンに分割し、各ゾーンにおける軟骨変性を0(最良)から5(最悪)までの間で採点した。各ゾーンについて得られた値を合計することによって、総軟骨変性スコアを計算した。最大軟骨変性スコアは15である。組織学的スコア付けは、3つの最も重度に罹患した連続切片(200μm間隔で)に対して行われる。各パラメータの値は、膝関節ごとに3つのスコア付きセクションで平均されます。データは中央値および95%CIとして提示された。我々は、MIA注射および対照の2週間後、6週間後に、軟骨下骨損傷スコアと軟骨変性スコアを比較した。 各群6匹のラットのn= 6膝。
疼痛関連行動テスト
疼痛関連行動の二つの別々の対策が評価された:の変化後肢重量配分と後肢の機械的な感度を。MIA誘発OAラットと対照ラットとの間の比較をMIA注射後6週間続けた( 各群n= 6ラット)。後肢体重負荷装置(Linton incapacitance tester、Linton Instrumentation、Norfolk、英国)を使用して体重分布を測定した。装置は、体重を測定することができる2つの力変換器からなる。動物が各後足に置くこと。ラットを後肢を2つの力変換器の中心に置いて無力容量試験機に置いた。左(同側)後肢の重量パーセント分布は、次式により算出した。左後肢の19%重量分布=左重量/(左重量+右重量)×100。
後肢の機械的感受性をフォンフレイフィラメントを用いて調べた。ラットを高架メッシュスチールプラットフォーム上に置かれたプレキシガラスケージの中に入れた。様々な曲げ力(0.4、0.6、1、1.4、2、4、6、8、10、15、26g)のフォンフレイフィラメントを、曲げ力の小さい順に両側足の足底表面に適用した。各フィラメントを約2〜3秒間、または離脱反応が現れるまで3回適用した。反応後、反応が起こらなくなるまで下降順に足でフィラメントを再試験し、その時点で反応が再び誘発されるまでフィラメントを昇順で再び適用した。脚引き込みを引き起こすための最終曲げ力を3回記録した。中央値を足の機械的閾値として記録した。
統計分析
Steel-Dwass検定を用いたKruskal-Wallis検定を用いて、MIAの6週間後、2週間後のCGRPおよびTrkA-IRニューロンの割合、体細胞サイズ範囲あたりのCGRP-IRニューロンの割合、軟骨下骨損傷および軟骨変性スコアを比較した。注射および対照ラット。マン – ホイットニー検定を用いて、MIA誘発OAラットと対照ラットの間の疼痛関連行動テストを比較した。P <0.05を統計的に有意と見なした。統計分析は、JMP、バージョン10(SAS Ins。Cary、NC)を用いて行った。
結果
免疫組織化学
図1は、MIA誘導OAのラットモデルから得られた同側DRGの切片におけるCGRP−およびTrkA − IRニューロンの代表的な画像を示す。抗CGRPおよび抗TrkA抗体についての陰性対照の染色はなかった。OAを有するラットは、膝関節を神経支配するDiI標識DRGニューロンの総数が有意に減少したが、軟骨下骨を神経支配するFB標識DRGニューロンのそれは変わらなかったことを示した(表I、表II)。OAラット(2および6週)の軟骨下骨を神経支配するニューロンにおけるCGRP-およびTrkA-IRの割合は、対照ラットのそれらより有意に高かった。さらに、6週目に軟骨下骨を神経支配するニューロンにおけるCGRP-およびTrkA-IRのパーセンテージは、2週ラットよりも有意に高かった(表1)。OAを有するラット(2および6週)の膝関節を神経支配するニューロンにおけるCGRP-およびTrkA-IRの割合は、対照ラットにおけるそれらより有意に高かったが、2および6週の間の差は有意ではなかった(表II)。
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図1。CGRP−およびTrkA − IRニューロン、ならびにFB−およびDiI−二重標識ニューロンの代表的な顕微鏡写真。遠位大腿骨の軟骨下骨を神経支配するFB標識ニューロンは青(矢印)(A、D)で示され、膝関節を神経支配するDII標識ニューロンは赤(矢印)(B、E)で示される。CGRP-またはTrkA-IRはそれぞれCおよびFに示されている。星印は、CGRP − IR、TrkA − IRおよびFB(黄色)、DiI(赤色)、FBおよびDil − double(白色)標識ニューロンを示す。左、中央、右は同じセクションです。図DおよびHは、それぞれ抗CGRP抗体および抗TrkA抗体についての陰性対照を示す。CGRP、カルシトニン遺伝子関連ペプチド。DiI、1,1’−ジオクタデシル−3,3,3 ‘、3’−テトラメチルインドカルボシアニンパークロレート。FB、ファストブルー; IR、免疫反応性。TrkA、チロシン受容体キナーゼA
表I。軟骨下骨を神経支配するDRGニューロンにおけるCGRPおよびTrkA発現の変化(A)。値は中央値(95%CI)
コントロール MIA注射後2週間 MIA注射後6週間
FB標識ニューロン(数)
[ n = 12ラット] 49(47–56) 51(47−55) 52(46〜56)
CGRP-IR(%)
[ N = 6匹のラット] 47.8(45.3 – 50.1) 53.6(51.3 – 55.8)∗、† 65.3(62.0 – 68.6)‡、∗∗
TrkA-IR(%)
Z [ N = 6匹のラット] 54.0(51.0〜56.3) 59.2(56.7〜63.1)∗、†† 68.6(64.8 – 72.7)‡、‡‡

P = 0.022。対コントロール。

P = 0.014。対MIA注射後6週間。

P = 0.014。対コントロール。
∗∗
P = 0.014。対MIA注射後2週間。
††
P = 0.022。対MIA注射後6週間。
‡‡
P = 0.022。対MIA注射後2週間。
表II。膝関節を神経支配するDRGニューロンにおけるCGRPおよびTrkA発現の変化。値は中央値(95%CI)
コントロール MIA注射後2週間 MIA注射後6週間
DiI標識ニューロン(数)
[ n = 12ラット] 159(155–167) 124(114–129)∗ 115(109 – 121)∗
CGRP-IR(%)
[ N = 6匹のラット] 40.5(38.8〜41.8) 61.2(56.5 – 63.9)† 60.6(56.6 – 65.5)†
TrkA-IR(%)
[ N = 6匹のラット] 51.3(45.8〜54.9) 67.8(63.4 – 70.7)† 66.1(61.2 – 71.7)†

P <0.001;対コントロール。

P = 0.014。対コントロール。
軟骨下骨および膝関節を神経支配するCGRP − 1Rニューロンの体細胞サイズ分布を図2(A)および(B)に示す。小さいサイズ(<600μm2)である軟骨下骨を神経支配するCGRP - IRニューロンの割合は、対照よりもOA(6週間)を有するラットにおいて有意に低かった(P = 0.033)。大型ニューロン(> 1200μm2)の割合は、対照および2週間のラットよりもOAを有するラット(6週間)において有意に高かった(P = 0.021;対照に対してP = 0.048; 2週間に対して)(図2)。(A)]。小さいサイズの膝関節を神経支配しているCGRP - IRニューロンの割合は、対照ラット(P = 0.033)よりもOAを有するラット(2および6週)において有意に低かった。大型ニューロンの割合は、対照ラットよりもOAラット(2および6週)の方が有意に高かった(P = 0.033)[ 図2(B)]。
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図2。体細胞サイズ範囲あたりの軟骨下骨(A)および膝関節(B)を神経支配するCGRP-IR DRGニューロンの割合。6匹のラットのL3およびL4 DRGを評価した。バーは95%CIを表す。
少数のFB-およびDiI-二重標識ニューロンが観察された[ 図1(A)、(B)]。FB標識ニューロンおよびDiI二重標識ニューロンの割合は、全FB標識ニューロンのうち4.3%(対照)、4.0%(2週間)および3.5%(6週間)であった。全DiI標識ニューロンのうち、値は1.6%(対照)、1.3%(2週間)および1.6%(6週間)であった。
膝関節の組織学的評価
膝関節の組織学は、膝へのMIAの関節内注射が関節軟骨および軟骨下骨損傷を引き起こしたことを示した。2週後には、軟骨下骨髄の間葉系の変化および潮汐での好塩基球増加を伴う関節軟骨の重度の損傷があった[図3 (B)]。6週間で、軟骨下骨の損傷はさらに悪化した。線維性組織による置換および小柱骨肥厚を伴う軟骨下骨の多病巣性および断片化が観察された[ 図3 ] 。(C)]。2週および6週の軟骨下骨損傷スコアは、対照ラットのものより有意に高かった。さらに、6週の軟骨下骨損傷スコアは、2週ラットにおけるものより有意に高かった(表III )。OAを有するラット(2週間および6週間)における軟骨変性スコアは、対照ラットにおけるものより有意に高かったが、2週間と6週間との間の差は有意ではなかった(表III)。軟骨下骨を神経支配するニューロンにおけるCGRPおよびTrkAの上方制御は、軟骨下骨損傷スコアと高い相関関係を示した(表IV)。
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図3。膝関節へのMIA注射後の組織学的変化の代表的な写真。対照ラットの軟骨および軟骨下骨は正常であった(A、D)。2週間で、プロテオグリカンおよび軟骨細胞の損失を伴う軟骨表面の重度の損傷(矢印)が現れた。軟骨下骨髄における間葉系の変化(二重矢印)および潮位における好塩基球増加の増加(矢印)が観察された(B、E)。6週で、線維性組織による置換を伴う軟骨下骨の多病巣性および断片化があった(矢頭)。重度の軟骨病変の領域に隣接する軟骨下骨の肥厚の増加も観察された(二重矢印)(C、F)。切片をで染色した。サフラニン Oとファストグリーン。
表III。軟骨下骨損傷スコアおよび軟骨変性スコアの変化。値は中央値(95%CI)
コントロール
MIA注射後2週間
MIA注射後6週間
軟骨下骨損傷スコア(0(最高)〜5(最悪)) 0(0〜0) 1.8(1.4–2.4)∗、† 4.6(3.4–5.1)‡
軟骨変性スコア(0(最高)から15(最低)まで) 0(0〜0) 11.5(9.5〜13.8)∗∗ 13.5(10.9〜15.4)‡

P = 0.008。対コントロール。

P = 0.013。対MIA注射後6週間。

P = 0.007。対コントロール。
∗∗
P = 0.008。対コントロール。
表IV。軟骨下骨求心路におけるCGRPおよびTrkA発現と軟骨下骨損傷スコアおよび軟骨変性スコアとの相関 値はスピアマンのrです
軟骨下骨損傷スコア P値 軟骨変性スコア P値
CGRPの発現 0.851 0.0001 0.467 0.126
TrkA発現 0.796 0.002 0.392 0.207
疼痛関連行動テスト
図4は、行動試験に対するOA誘導の効果を示す。疼痛に関連した行動、すなわち、足の非対称的な体重分布および機械的痛覚過敏が、OA群において1〜6週間で観察された[ 図4 ]。しかしながら、同側後足の体重分布の百分率は実験の過程を通して減少したが、一方、足の機械的痛覚過敏は4から6週間にわずかに逆転した。
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図4。行動試験に対するOA誘発の影響 (a)インキャパシタンステスターを用いた同側後足の体重分布のパーセント、(b)フォンフレイフィラメントに対する機械的閾値。値は平均±95%CIである。*P = 0.005。対コントロール。#P = 0.003。対コントロール。$ P = 0.002。対コントロール。**P = 0.004。対コントロール。## P = 0.006; 対コントロール。
討論
私たちの知る限りでは、これはMIA誘発OAラットにおける大腿骨遠位部の軟骨下骨を神経支配するDRGニューロンの侵害受容表現型の変化を評価する最初の研究である。本発明者らの結果は、軟骨下骨を神経支配するニューロンにおけるCGRPおよびTrkAの発現が6週間にわたって徐々に増加したことを示し、これは軟骨変性スコアではなく軟骨下骨損傷スコアと相関しなかった。これらの結果は、特に進行期の膝OAの場合には、それ自体が軟骨下骨が治療標的であることを示唆している。疼痛関連行動試験に関しては、実験の過程を通して後肢の非対称的な体重分布が観察されたが、機械的痛覚過敏足の4〜6週間でわずかに逆転した。これらの結果は、軟骨下骨を神経支配するニューロンにおけるCGRPおよびTrkA のアップレギュレーションが、特に進行性膝関節症OAの場合には、体重負荷の痛みと関係があるかもしれないことを示唆している。実際、最近の臨床研究では、軟骨下BMLは独立して体重負荷と関連しているが、体重負荷がない膝疼痛とは関連が少ないことが示唆されている20。一方、ニューロンにおけるCGRPとのTrkA発現は、以前の研究と一致していた2週間後にピークに増加膝関節、神経支配21、22。これらの結果は、滑膜や半月板などの関節内組織が発生に役割を果たす可能性があることを示唆している。初期段階からのOAの関節痛
我々の結果は、OAが、軟骨下骨と膝関節の両方を神経支配するCGRP-IRニューロンの体細胞サイズ分布の変化を誘導することを示した。軟骨下骨を神経支配する大型のCGRP − IRニューロンは、時間とともに軟骨下骨損傷と共に徐々に増加した。大細胞がCGRPを発現し始めるという事実は、MIA誘導性OA23、末梢神経損傷24、頸椎面損傷25および関節固定化26を有するラットにおいて既に観察されている。大型ニューロンにおけるCGRPの発現は肥大に起因する可能性がある なぜなら、小サイズのCGRP - IRニューロンは、この研究においてOAを有するラットにおいて有意に減少したからである。
最近のヒト臨床試験は、NGFをブロック治療が著しく膝OAにおける関節痛を減少させたことが示された27、28、29 。NGF媒介細胞効果は、異なる結合親和性を有する少なくとも2つの受容体、すなわち低親和性受容体p7530および高親和性受容体TrkA31によって調節される。TrkAが機能的NGFシグナル伝達に必須であることは確立されているようです32。我々の研究は、初代軟骨下骨および膝関節求心性神経におけるTrkA-IRニューロンの上方制御を示した。NGF-TrkAシグナル伝達を標的とする治療戦略は、軟骨下骨および関節内組織からの疼痛を軽減するために有望である。
我々は、膝関節を神経支配するDRGニューロンの総数が、OAを有するラットにおいて有意に減少することを観察した。この減少は、軸索損傷または末梢神経によるDiI の取り込みの変化23に起因する可能性があります。以前の研究ので、 21、 33は、関節内2mgのMIAは、のマーカーの発現の増加が生じたことを示した末梢神経損傷を膝関節を神経支配するDRGニューロンにおける(転写因子3の活性化)。一方、軟骨下骨を神経支配するDRGニューロンの総数は、MIA注射後も変化しなかった。これは、ラットがMIA注射時に無傷の骨軟骨接合部を有していたので、軟骨下骨の末梢神経が関節内MIAによって損傷を受けなかったことを意味するかもしれない。それ故、高用量MIAによる末梢神経損傷は、軟骨下骨を神経支配する末梢神経の変化の結果を議論することに関してのみ考慮されないかもしれない。
この研究にはいくつかの潜在的な制限があります。第一に、骨に穴を開けると炎症反応を引き起こし、DRGにおけるCGRPまたはTrkAのアップレギュレーションを引き起こす可能性があります。しかしながら、調製後の炎症反応は対照ラットでも同様に起こるので、我々はこれらの影響は無視できると考える。第二に、神経ペプチドは骨成長中の骨代謝において重要な要素であるため、CGRP-IR 神経線維の数が骨発達中に増加したことが報告されている34。。それによって、軟骨下骨を神経支配するCGRP - IRニューロンの割合は、ラットが何週齢であるかによって異なる。実際、6週齢のラットの軟骨下骨を神経支配しているCGRP-およびTrkA-IRニューロンの割合は、骨が代謝的に活性であった3週齢のラットよりも低かった10。本研究では、OAのラットモデル使用して、以前の逆行性標識の研究による250〜300グラムの重さの6週齢のラットを使用した21、23、35。第三に、この研究では少数のFBおよびDiI二重標識ニューロンが観察された。予備実験で、FBが関節内腔に浸透しないことを確認し、トレーサーの証拠を示す膝を除外した。本研究では穿孔から周辺組織への漏出 しかし、微量のトレーサーが膝関節やドリル穴に漏れた可能性を否定することはできません。FB-とのDiI-二重標識ニューロンのための別の可能性のある説明は、以前の研究で確認されているように発散ボディ領域に突出する二分繊維とDRGニューロンの存在である36、37、38、39。
結論として、軟骨下骨を神経支配するニューロンにおける侵害受容マーカー(CGRPおよびTrkA)の上方制御は、軟骨下骨損傷と高い相関を示し、それは、特に進行期膝関節の場合、軟骨下骨それ自体が治療標的であることを示唆する。 OA 特に、CGRPおよびTrkAは、OAにおける軟骨下病変に関連する関節痛を治療するための潜在的な分子治療標的である。
投稿者の投稿
KAとMIは実験を計画し、結果を分析し解釈し、そして原稿を書いた。KAは免疫組織化学、組織学的分析および疼痛関連行動試験を行った。MI、NS、YOは結果を分析し、解釈しました。TUは研究を指揮した。
利益相反
この研究に関連したいかなる利益相反もありません。
資金源
この研究は、高知大学高知医科大学の助成金(34001349)によって支えられています。
謝辞
免疫組織化学と組織学的分析に関して、矢口健一さん(高知医科大学)と白石玲香さん(高知医科大学)に大変貴重なご支援をいただき、ありがとうございます。
付録A 。補足データ
以下は、この記事に関連する補足データです。
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補足図1。大腿骨遠位骨端に注入された黒インクは、対照ラット(A、D)とOAラット(2週間(B、E)および6週間)の間で同様に関節内および骨幹への漏出なしに遠位大腿骨の内側顆および外側顆に浸透した。C、F)MIA注射後)重度の軟骨下骨硬化症が存在する場合でも 骨端板は、骨幹(矢印)から大腿骨遠位骨端を分離しました。矢印は注入孔(直径1mm)を示す。
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